南昌链霉菌南昌霉素生物合成基因簇的克隆与分析及其药物创新潜力

南昌链霉菌南昌霉素生物合成基因簇的克隆与分析及其药物创新潜力

一、南昌链霉菌中南昌霉素生物合成基因簇的克隆分析及其药物创新潜力(论文文献综述)

王海燕[1](2020)在《冰城链霉菌米尔贝霉素高产菌株的工程改造 ——基于次级代谢物生物合成基因簇关系解析》文中提出米尔贝霉素(milbemycins)是一类16元大环内酯类抗生素。由于高效低毒、易降解、无环境污染的优良特性,米尔贝霉素已作为生态友好型农药被商业化应用于多种农作物、经济作物及花卉的害虫防治,其半合成药物米尔贝肟被评价为最安全的抗寄生虫药,用于预防及治疗猫、犬类的寄生虫病。然而米尔贝霉素原料药较高的发酵生产及提纯成本限制了米尔贝霉素类药物的广泛使用。本文以米尔贝霉素工业生产菌株冰城链霉菌的全基因组、转录谱数据为基础,通过对冰城链霉菌中所有潜在的次级代谢生物合成基因簇的时序转录谱进行聚类分析,发现了与米尔贝霉素生物合成基因簇mil共表达的一个Ⅱ型聚酮类次级代谢物生物合成基因簇kel负责黄色化合物的合成。我们发现分别敲除kel簇内的调控基因kelR和结构基因kelCD对米尔贝霉素产量的影响是相反的,敲除结构基因kelCD提高了米尔贝霉素产量,敲除调控基因kelR却完全阻断了米尔贝霉素的产量。为了解释此现象并阐释kel簇与mil簇之间的关系,对调控基因kelR的功能及调控机制进行了解析,同时检测了敲除kelCD对米尔贝霉素合成所需前体酰基辅酶A浓度的影响,明确了米尔贝霉素和黄色化合物既竞争相同的前体又被来自于kel簇的转录因子KelR共激活的复杂关系。之后,通过转录组测序,发现了另外两个与mil共表达的基因簇cluster1-typeⅠPKS,cluster41-otherKS也被KelR调控。而敲除cluster1和cluster4 1中的核心生物合成酶基因提高了米尔贝霉素的产量。最终,基于上述三个生物合成基因簇与mil代谢竞争且共调控的关系,确定了敲除核心结构基因,同时过表达正调控基因kelR的工程改造策略,使米尔贝霉素A3/A4 产量提高到了 4058.2±71.0 mg/L。总之,本文鉴定了三个与米尔贝霉素合成基因共表达的次级代谢物合成基因簇,并详细阐述了冰城链霉菌中基因簇之间代谢竞争且转录共调控的复杂关系,提出了敲除核心合成酶基因并过表达转录激活子的工程改造策略,为米尔贝霉素高产菌株构建提供了基础。同时本文首次发现并阐释了一个新的米尔贝霉素生物合成的底层激活子KelR,为米尔贝霉素合成调控机制的解析提供了理论基础。

李鑫[2](2020)在《基于大片段克隆技术的罗中链霉菌TRM49605次生代谢产物基因簇挖掘》文中研究指明放线菌具有丰富的次级代谢产物,是挖掘新型药物的重要来源。新疆典型极端盐碱环境蕴含着大量放线菌新物种,放线菌在适应高盐碱等极端环境可能演化出独特的次级代谢产物,进而引起国内外研究者的关注。本研究选择来自新疆典型极端盐碱环境罗布泊地区一株链霉菌新物种TRM49605对其进行基因簇分析,采用Red/ET重组技术对3个基因簇进行克隆和异源表达。通过异源表达,确定生物合成基因簇的生物学功能,以期获得结构新颖、活性较强的次级代谢产物,同时为后期基因改造以及组合生物学储备基因资源。(1)罗中链霉菌次级代谢潜力分析为探索罗中链霉菌(Streptomyces luozhongensis)TRM49605次级代谢潜能,本研究对其进行全基因组测序分析,结果表明罗中链霉菌基因组DNA全长7 156 507 bp,通过antiSMASH分析发现其潜在天然产物生物合成基因簇有63个。为探究不同相似性基因簇异源表达情况,评估TRM49605次级代谢潜能,选取3个代表基因簇进行分析,其中,Cluster24是一个核苷类抗生素生物合成基因簇,全长29 393 bp,由26个基因组成,与衣霉素基因簇相似性为92%;基因簇Cluster17全长17 066 bp,由14个基因组成,与dutomycin生物合成基因簇相似性为4%;Cluster36全长44 395 bp,由42个基因组成,含有多个缬氨霉素相关的基因,与缬氨霉素基因簇相似性为16%。分析结果表明罗中链霉菌具有丰富的次级代谢潜能,其中具有已知的生物合成基因簇,也有未知功能的生物合成基因簇,具有深度挖掘的潜力。基因组分析及相关基因簇的预测为准确评估罗中链霉菌次级代谢潜能提供参考数据,同时为后基因组时代的天然产物挖掘提供工作基础。(2)基因簇的克隆及异源表达为确定TRM49605的生物合成潜力及相关基因簇生物学功能,本研究基于Red/ET系统对Cluster24、Cluster17和Cluster36进行克隆,将目的基因簇通过接合转移导入天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145中进行异源表达。通过HPLC检测分析,获得Cluster24基因簇的产物-衣霉素,与预测相符;其它2个基因簇未检测到预期产物,也未发现区别于宿主菌的其它特征峰出现。后将异源宿主菌更换为Streptomyces lividansTK64通过更换发酵培养基,尚未找到目的产物及与异源宿主菌的差异,分析原因可能是所选基因簇不完整,不具备合成某一产物的能力。通过衣霉素异源表达产物生物活性实验发现携带有衣霉素生物合成基因簇的重组菌Streptomyces coelicolor::pTRM605-24-03对枯草芽孢杆菌具有明显抑菌活性,是潜在的药物先导化合物,具有深度研究价值。本研究结果表明,相似性较高的基因簇具有更完整的生物合成酶系统,异源表达获得产物可能性更大。本研究基于后基因组时代的基因簇挖掘,初步揭示了链霉菌TRM49605生物合成潜力,为今后的基因簇分析以及天然产物挖掘提供指导思路和技术支持。

田文佳[3](2019)在《内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征及wblA基因的调控功能》文中研究表明药用植物内生菌所处生境独特,经过与植物的长期共同进化而具有合成新颖天然产物活性结构的巨大潜力。本实验室前期从19种药用植物中分离得到94株拮抗内生菌,论文通过多步骤活性检测方法,结合生物信息学分析对其抑菌机制进行初步预测,并利用基因工程和qPCR技术进行验证,来探索目标菌株的抑菌活性特征。论文主要包括如下四部分内容:1.多步骤活性检测方法确定目标菌株SAT1。将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为指示菌,以94株拮抗内生菌为研究对象,初步筛选得到8株抑菌效果较强(抑菌带宽>1.0 cm)的菌株。通过抑菌谱实验、发酵液抑菌活性实验以及离体枝条实验等多步骤分析,发现内生链霉菌SAT1对栗疫菌、白假丝酵母等八种指示菌均具有抑制效果,并且对欧美杨溃疡病和板栗疫病表现出一定的生防效果,优于其它菌株,因此,将其作为本论文的研究对象。2.SAT1次级代谢基因簇抑菌活性物质预测。通过antiSMASH分析Streptomyces sp.SAT1全基因组序列,一共预测到29种次级代谢产物生物合成基因簇。其中Cluster24和Cluster25与具有抑菌活性的潮霉素B和默诺霉素的生物合成基因簇分别有52%和88%的相似性。经同源性比对分析,Cluster24含有23个基因,与吸水链霉菌相比hygT、hygH、hygG、hygZ四个基因的蛋白同源性较低(仅为32%-40%);在Cluster25中,moeR5和S5同源性仅为28%和45%。因此,我们推测这两个基因簇可能合成潮霉素B和默诺霉素类的新物质。3.wblA强化表达突变株的抑菌活性。wblA基因为多效性负调控基因,多个研究表明该基因除了能够影响链霉菌孢子形成外还能够影响多种次级代谢产物的生成。本研究将两个含有wblA基因的不同长度的片段W1(2411 bp)和W2(854 bp)插入pSET152载体,分别获得wblA强化表达突变株SAT1-W1和SAT1-W2。抑菌结果表明,两株突变株的抑菌活性相较于野生型均有明显下降,说明wblA的强化表达对抑菌相关基因产生了抑制作用。4.通过qPCR技术分析Cluster24和Cluster25中相关基因表达量的影响。以看家基因rpoA和recA作为共同内参来检测目的基因的表达量。相对定量结果表明,wblA在SAT1-W1和SAT1-W2中的表达量分别增长为野生型的2.45倍和2.54倍。在SAT1-W1中,Cluster24中的hygM、hyg0、hygP三个基因几乎不再表达,而在SAT1-W2中分别降为原来的72-88%;另外Cluster25中的moeA5、moeP5、moeGT2在SATl-W1中的表达量下降为原来的29-60%,在SAT1-W2中反而升高了 1.19-1.95倍。因此我们猜测Cluster24所合成的物质具有抑制真菌的活性,而Cluster25指导产生的物质还需要进一步的验证。本论文详细研究了内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征以及可能发挥作用的次级代谢基因簇。为后续深入研究SAT1的抑菌机制、分离活性物质以及构建高产抗生素功能菌株提供了理论支持。

吕玲玲[4](2018)在《罗布泊嗜(耐)盐放线菌的物种多样性、抗生素合成基因以及盐胁迫响应机理初探》文中研究指明罗布泊及周边极端高盐碱环境蕴藏着丰富多样的嗜(耐)盐放线菌资源,是挖掘放线菌物种多样性、生物活性多样性、次级代谢产物多样性和嗜(耐)盐机制的宝藏。本论文采用可培养法对罗布泊及其周边23份高盐碱土壤样品进行了放线菌物种的分离、收集、保存和16S r DNA聚类分析,获得了262株嗜(耐)盐放线菌,其中有13株潜在新种;分离并鉴定了6个放线菌新物种;对获得全部菌株进行了耐盐特性、抗菌活性以及PKS I、PKS II、NRPS和APH等抗生素生物合成基因簇的筛选研究;从6株放线菌发酵液中分离鉴定了13个单体化合物;同时采用转录组比较分析法对一株极端嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理进行了初步探索。具体研究结果包括:1.罗布泊及其周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌多样性研究从23份土样中共分离获得了262株嗜(耐)盐放线菌,5株为耐盐放线菌,257株为嗜盐放线菌,发现放线菌潜在新种13个,可能代表新的分类单元。通过16S r DNA聚类分析,将所获放线菌归属于4亚目5科8属,分别为放线多孢菌属(Actinopolyspora)、糖霉菌属(Glycomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、链单孢菌属(Streptomonospora)、链霉菌属(Streptomyces)和拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)。其中,拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)是罗布泊盐湖的主要类群,占该区域分离获得菌株的37.04%,放线多孢菌属(Actinopolyspora)是罗布泊周边盐碱土的主要类群,占该区域分离获得菌株的25.20%。2.放线菌新物种的多相分类采用多相分类方法鉴定了6株放线菌新物种。其中,放线菌TRM 45123为糖多孢菌属新物种,命名为耐盐糖多孢菌(Saccharopolyspora halotolerans);放线菌TRM45387、TRM 45198和TRM 45127为糖霉菌属新物种,分别命名为塔里木糖霉菌(Glycomyces tarimensis)、新疆糖霉菌(Glycomyces xinjiangensis)和罗布泊糖霉菌(Glycomyces lopnorensis);放线菌TRM 45668和TRM 45658为嗜盐多孢菌属新物种,分别命名为塔里木嗜盐多孢菌(Halopolyspora tarimensis)和罗布泊嗜盐多孢菌(Halopolyspora lopnorensis)。3.抗生素合成基因和抗菌活性筛查262株放线菌PKS I、PKS II、NRPS和APH基因的筛查结果表明,阳性率分别为46.94%、25.57%、22.90%、21.76%。四种功能基因在不同种属之间的分布存在一定差异,PKS I、PKS II基因在各个属都有分布,PKS II基因较PKS I基因分布明显要少,而且绝大多数含有PKS I基因的菌株不含有PKS II基因;NRPS基因主要分布在Actinopolyspora和Streptomyces;APH基因分布于Glycomyces和Nocardiopsis。262株放线菌的生物活性检测得出,有75株放线菌至少对一种病原菌具有拮抗作用,阳性率为28.6%。这些菌株分布于Streptomyces、Nocardiopsis、Actinopolyspora、Saccharopolyspora、Glycomyces、Streptomonospora和Saccharomonospora,阳性率分别为14.5%、8.4%、7.3%、1.1%、1.1%、0.8%和0.4%;活性菌株以Streptomyces最多,而这些活性菌株大部分均含有一种或一种以上的抗生素生物合成基因。4.放线菌次级代谢产物的分离纯化与结构鉴定采用现代色谱分离技术和核磁共振(NMR)等波谱鉴定技术,从6株放线菌活性菌株发酵液中分离鉴定了13个化合物,分别鉴定为3,4-二氢-6,8-二羟基-3-甲基异香豆素(45037-1)、2-甲基-1,4-苯二醇(45037-2)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)二酯(45037-3)、1,6-二羟基吩嗪(45037-4)、16α-甲基-11β,17α,21-三羟基-9α-氟孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮21-醋酸酯(45306-1)、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(45306-2/45556-3)、Nb-乙酰色胺(45306-3/45380-1)、N-丙酰色胺(45306-4)、4′,7-二羟基异黄酮(45556-1)、4′,5,7-三羟基异黄酮(45556-2/45214-1)、大豆皂醇B(45214-2)、1-庚基-2-甲基-3-羟基咔唑(45040-1)和8-庚基-4,5,6-三羟基酞酸(45040-2)。这些化合物均首次从这些菌株的次级代谢产物中分离获得。5.一株嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理初探菌株TRM 45611在8%(最低盐浓度生长)、17%(最适生长盐浓度)和25%NaCl(最高盐浓度生长)浓度下转录组比较分析结果表明:以8%Na Cl组为对照组,17%Na Cl组和25%Na Cl组与对照组相比,从生物过程分类中显示菌株在盐胁迫过程中有细胞代谢、生物调节和次级代谢产物等过程参与;在细胞组分分类中显示菌株的盐胁迫与细胞器,还有大分子化合物,如蛋白质、核酸、糖类或脂类的运输代谢等密切相关,同时,这些代谢过程在菌株耐盐中起着重要作用;在分子功能分类中显示菌株的盐胁迫响应机制中,结构分子活性、酶催化活性和分子转运活性也密切相关。不同盐浓度条件下的差异表达基因的比较发现,以8%Na Cl组为对照组时,17%Na Cl组表达量上调的基因有78个,表达量下调的有155个;25%Na Cl组表达量上调的基因有383个,表达量下调的有302个。综上所述,本论文在分离并鉴定嗜(耐)盐放线菌的基础上,初步揭示了新疆罗布泊地区嗜(耐)盐放线菌的物种多样性和主要类群;评价了抗生素功能基因多样性、抗菌活性和耐盐特性;在抗生素生物合成基因和生物活性双重评价基础上分离鉴定了部分菌株的次生代产物;同时在转录组水平上探讨了一株极端嗜盐菌的盐胁迫响应机制。以上研究结果对新疆嗜耐盐放线菌资源的保护利用提供了重要参考。

谭超,谭华荣,张集慧[5](2016)在《盐霉素产量提高及其活性优化》文中研究表明盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的一元羧酸聚醚类抗生素,具有较强的抗革兰氏阳性菌和杀灭球虫的作用,而且对环境污染也较低;此外,还能特异性地抑制多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞的生长,具有多重作用靶点,有望成为抗肿瘤的特效药。为提高盐霉素的产量,人们采用传统诱变技术和现代分子遗传学手段,对盐霉素产生菌进行了改造,获得了高产菌株;同时,通过对盐霉素化学结构进行修饰或者通过药物载体和联合用药等,增强了其活性和靶向性、减少了毒副作用。本文对盐霉素产生菌的改造策略、药物靶向性提高和活性优化等研究进展进行综述,并对今后的研究热点进行展望。

芦晨阳[6](2016)在《井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造》文中研究说明微生物的次级代谢产物一般在细胞指数生长后期或者稳定期开始合成,它们具有多种生物活性,在医疗健康、农牧业生产等领域发挥着重要作用。负责细胞生长的初级代谢和负责代谢产物合成的次级代谢之间存在密切关系,次级代谢所需的前体、能量和还原力来源于初级代谢,而初级代谢本身同样会消耗这些前体、能量和还原力用于细胞生长。以多组学的数据分析为基础,阐明抗生素的高产机理,弱化初级代谢途径,削弱或减缓细胞生长速率,缩短次级代谢产物的发酵周期,全面提高次级代谢产物的产量是本论文研究的重点。第一部分“弱化初级代谢提高抗生素产量”的改造策略井冈霉素是应用范围最广的农用抗生素之一,主要用来防治水稻纹枯病,同时也是治疗Ⅱ型糖尿病的药物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前体,具有很高的经济附加值。通过对井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种5008(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)(产量3-5 g/L)及其衍生的高产菌株TL01(产量20-30 g/L)的比较基因组学分析,我们旨在阐明井冈霉素的高产机理,进而指导其产量的进一步提升。5008和TL01全基因组精细图谱的分析发现,TL01中存在总计300 kb的三个大片段区域的缺失,每个区域的单独缺失对产量提高均有贡献,而组合缺失突变株产量达到TL01的80%,是井冈霉素高产的关键因素。而随着井冈霉素产量的逐步提高,菌体生物量却表现出逐渐下降的趋势,暗示生物量和井冈霉素产量之间存在负相关。据此我们提出了“弱化初级代谢可以提高抗生素产量”的假说,推断大片段的缺失弱化了菌体的初级代谢,削弱或减缓了菌体的生长,将更多的代谢流用于井冈霉素的生物合成,促进井冈霉素产量的提高。基于此假说,我们对区域Det-I和Det-Ⅲ中的120个基因进行了排查,找到了参与初级代谢过程的结构基因和调控基因shjg115、shjg1601、shjg1609和shjg1617,它们的缺失使得产量均有不同程度的提高、生物量有不同程度的降低。此外,代谢组的数据分析发现,在6-磷酸葡萄糖节点上代谢流的分配进一步的趋向于磷酸戊糖途径(PPP),而糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)中的碳流量下降,这进一步支持了我们提出的“弱化初级代谢可以提高抗生素产量”的假说。为了验证该假说的普适性,我们在红色糖多孢菌属、链霉菌属和小单胞菌属的抗生素产生菌中对糖酵解途径和三羧酸循环中多个催化步骤的同功基因进行了敲除,扰动初级代谢,减缓细胞生长,成功实现了红霉素A、林可霉素A和庆大霉素C组分产量的提高。此外,在阿维菌素高产菌株阿维链霉菌76-5中组合缺失柠檬酸合成酶基因、琥珀酰辅酶A合成酶基因和琥珀酸脱氢酶基因,突变株产量提高了0.77 g/L,增幅达到52%。但是进一步弱化初级代谢减少生物量,产量反而锐减,暗示着一定的生物量积累是抗生素高产的重要前提。另外,转录芯片数据分析发现线型质粒pSHJG1在TL01中整体呈现低表达趋势,推断pSHJG1与井冈霉素的合成没有正相关性,可以被进一步消除,降低产生菌基因组的复杂性。质粒消除突变株中井冈霉素及其前体效氧胺的产量均有大幅提高,但是生物量下降,而生物合成基因簇的转录量保持不变。随后我们在pSHJG1中确定了和初级代谢相关的结构基因,使用valA基因启动子在突变株中进行基因回补,发现基因pshjg1.69和pshjg1.72的回补使得井冈霉素产量和生物量均恢复到接近出发菌株的水平。无论是初级代谢的弱化还是线型质粒的消除,它们都能够弱化或者减缓细胞生长,进而促进抗生素产量的提高。由于放线菌初级代谢途径和细胞生长息息相关,而且相对大的基因组中普遍存在多个同功基因,因此弱化初级代谢以提高抗生素产量的策略更具有普适性。第二部分盐霉素产生菌基因组解析及定向高产改造盐霉素是聚醚类抗生素的典型代表,由于具有治疗鸡球虫病的活性,在畜牧业被广泛使用。最近发现它也具有潜在的杀灭肿瘤干细胞的活性。盐霉素发酵过程表现出很强的豆油利用偏好性,且产量会随着豆油浓度的提高而增加,工业发酵水平达到70 g/L以上。但是迄今为止,对其高产机理和豆油利用偏好性产生的原因尚不知晓。盐霉素产生菌白色链霉菌DSM 41398(Streptomyces albus DSM41398)的全基因组精细图谱由本实验室测定,其线型染色体全长8,384,669 bp,无线型质粒存在。和其他常见链霉菌基因组的比较分析发现,DSM 41398中参与脂代谢的基因比例和数量是最高的,与豆油分解和β氧化相关基因总数达到48个,且其中基因fadD、acd、paa、fadJ和fadA均表现出豆油诱导表达的现象;而与此相反,参与碳水化合物代谢的基因比例是最低的,这暗示着菌株具有内在的强化的脂代谢能力和弱化的糖代谢能力,与其特殊的豆油偏好性表型恰好吻合。除了盐霉素生物合成基因簇以外,DSM 41398的染色体中还存在其他9个I型PKS/PKS-NRPS生物合成基因簇,其中7个是活跃表达的,它们可能会和盐霉素生物合成竞争前体,不利于盐霉素的产生。对7个活跃表达的基因簇进行逐个敲除后发现,除了PKS-5,其他基因簇的中断都有助于盐霉素产量不同程度的提高,其中PKS-NRPS-2和PKS-6的缺失突变株产量提高最为显着,分别提高了8.5倍和2.67倍,但是它们的组合缺失突变株的产量却不能被进一步提升。通过LC-MS/MS进行了胞内辅酶A的定量分析,我们发现组合缺失突变株中,前体丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A的浓度均比单独缺失突变株的高,但是乙基丙二酰辅酶A的浓度基本保持不变,由此成为产量进一步提高新的限制因素。通过超量表达了巴豆酰辅酶A还原酶基因ccr,我们有效提高了乙基丙二酰辅酶A的胞内浓度,并最终将组合缺失突变株的盐霉素产量提高至6.6 g/L,达到了出发菌株的10倍左右。在高产菌株中我们使用同样的检测手段和改造策略,也实现了盐霉素产量的进一步提升。综上所述,本论文通过基因组学、转录组学、代谢组学的手段,解析了井冈霉素和盐霉素的高产机理,并定向改造高产菌株,得到了产量进一步提高的衍生菌株。此外,本论文中提出的“弱化初级代谢提高抗生素产量”,“线型质粒消除”和“基于定量的前体工程改造”等策略可以为其他抗生素的高产改造提供一定的借鉴。

陶立彬[7](2015)在《淀粉酶产色链霉菌1628合成丰加霉素关键基因的研究》文中研究指明丰加霉素(Toyocamycin,TM)是核苷类抗生素家族中的一员。它在抑制真菌方面表现出很高的活性,在植物病害防治领域具有重要的应用潜力。本论文针对TM生产菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628产量低等问题,克隆了涉及S.diastatochromogenes 1628丰加霉素生物合成的多个功能基因,利用代谢工程手段有效提高了S.diastatochromogenes 1628的丰加霉素的合成水平。首先,以S.diastatochromogenes 1628 DNA为模板,设计简并引物,克隆得到参与TM生物合成大小分别为1443 bp的toy F(编码腺苷酸琥珀酸裂解酶)(Gen Bank登录号:JQ267374)和1284 bp的toy G(编码腺苷琥珀酸合成酶)基因(Gen Bank登录号:KF517415),其分别与已公布的多株链霉菌对应基因的氨基酸序列具有很高的相似性,其中与S.venezuelae ATCC 10712的氨基酸序列同源性最高,分别为90%和95%。将toy F和toy G基因分别置于链霉菌整合型载体p IB139中的Perm E*启动子下游,构建了重组载体p IB139-toy F和p IB139-toy G,通过接合转移法获得重组菌1628-TOYF和1628-TOYG。将原始菌株1628与重组菌1628-TOYF、1628-TOYG进行TM发酵、酶活分析及细胞干重检测。重组菌中的TM产量和相应的酶活TOYF(TOYG)均高于原始菌。其中,重组菌1628-TOYG TM产量增幅最高达26.2%。其次,以S.diastatochromogenes 1628 DNA为模板,设计简并引物,克隆了大小为558bp编码核糖体再循环因子frr基因,其与Streptomyces flavogriseus ATCC 33331、Streptomyces venezuelae ATCC 10712和Streptomyces sp.NRRL F-2580菌株的Frr氨基酸序列同源性最高,分别为92%、92%和89%。在S.diastatochromogenes 1628中过量表达了frr基因,获得重组菌1628-FRR(整合p IB139-frr)。1628-FRR与原始菌株1628发酵性能相比,TM产量增加了41.1%,细胞干重增长了21%,发酵时间从84 h缩短至72 h。通过RT-PCR分析发现,与原始菌株1628相比,重组菌1628-FRR中基因toy F和toy G转录水平均有提高,且基因toy G转录水平增加更为明显。另外,利用基于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度检测实验发现,frr基因的过量表达能加速蛋白合成,发酵过程中后期此效果尤为显着,从而导致TM产量的提高。最后,将toy G基因分别与frr以及编码透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)的vgb基因串联,以及三基因串联表达考察对1628菌株合成TM的影响。发酵结果显示,在构建的多株重组菌中,vgb、frr和toy G基因分别置于Perm E*启动子下的三基因串联表达的重组菌1628-VGF,TM产量最高,该菌株发酵72 h时TM产量达到319.2 mg/L,而原始菌株1628发酵84 h时TM产量只有147.1 mg/L,TM的生产强度从提高1.75 mg?L-1?h-1至4.43 mg?L-1?h-1。此文构建的重组菌1628-VGF为丰加霉素规模化生产奠定了良好的基础。

颜一军[8](2013)在《冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究》文中认为链霉菌是一类广泛分布在地球上,特别是土壤中的,具有分枝丝状体的革兰氏阳性菌,属于细菌域(Bacteria)放线菌目(Actinobacterales)链霉菌科(Streptomycetaceae)。它能产生大量的天然产物,像抗生素类,驱虫剂类,除草剂类,抗肿瘤药物及免疫抑制剂等。而此次测序的冰城链霉菌首次在中国哈尔滨的土壤样本中被分类得到,它能产抗寄生虫药物米尔贝霉素A3和A4,具有潜在的工业化应用前景。我们还从这株菌株分离得到了10个新的米尔贝霉素类似物,包括4个米尔贝霉素α类,2个米尔贝霉素β类,4个米尔贝中间产物,2个新的环肽类化合物bingchamides A and B和大环内酯类化合物ST906。同时这株菌也产一种聚醚类抗生素南昌霉素。此次实验我们首次通过Illumina Solexa测序技术成功获得了冰城链霉菌的全基因组序列信息。并通过软件Glimmer和次级代谢产物数据库,对冰城链霉菌的基因进行了预测和注释,特别是跟次级代谢产物相关的基因簇的分析,初步分析发现在冰城链霉菌中有23个基因簇参与聚酮类,非核糖体多肽类和萜类等次级代谢产物的生物合成。由于冰城链霉菌的基因组是目前为止已测序的链霉菌基因组中最大的,所以我们又对其基因组的构成进行分析,发现有3个因素可能导致了冰城链霉菌基因组的扩展,一是水平基因转移,特别是GC含量比较低的地方;二是重复基因,功能基因的重复在进化上使得链霉菌能更好的适应环境的变化;三是转坐子及相关的转坐酶,它们的大量存在也使的冰城链霉菌扩大对外源基因吸收。所以这次的全基因组测序除了帮助我们更好的了解米尔贝霉素生物合成的机理,同时也对其他次级代谢产物的合成途径提供参考。从而为今后对冰城链霉菌的遗传改造,以获得米尔贝霉素的高产菌株打下坚实的基础。戊二酰亚胺聚酮类化合物都具有一个戊二酰亚胺的六元环,环的C-4上连着一段聚酮的侧链,侧链大部分成环,也有少数为直链。这一家族的天然抗生素包括cycloheximide, streptimidone,9-methylstreptimidone以及migrastatin类化合物。而且这一家族的成员大多具有抑制癌细胞迁移的活性,因此是很有发展潜力的新型抗肿瘤药物制剂。放线菌酮(Cycloheximide)作为真核生物蛋白合成抑制剂,被广泛应用于体外的生物医学研究,他能特异的结合在真核生物核糖体的60S亚基上,从而阻断蛋白翻译的延伸。但到目前为止,放线菌酮的生物合成途径却并不被人所了解,因而本实验室选取Streptomyces. Sp. YIM56141作为研究对象,对其的放线菌酮的生物合成途径进行了研究。得到放线菌酮和放线菌酚的基因簇后,我们选取了13个基因进行了基因敲除实验,发现敲除chxB、chxC、chxD、chxE后,这两种化合物都不产了,而且根据功能分析,这几个基因都跟聚酮链的合成相关,所以我们就推测6分子的丙二酰辅酶A在ChxB(游离的酰基转移酶)的帮助下结合到聚酮合酶ChxE后形成聚酮链,1分子的谷氨酰胺在ChxD的作用下则参与戊二酰亚胺基团的合成。最后由TE功能域从聚酮合酶上水解下来,就得到了中间产物。接着的工作就由四个后修饰酶起作用了,首先,我们在中断掉chxJ和chxI后,并没有积累到中间产物,说明从聚酮链上水解下来的中间产物并不稳定,难以分离得到,但我们通过功能比对发现ChxJ具有羧酸还原酶特性,能在ATP和NADPH的帮助下可将C14位上的羟基还原,最终在C14位上形成酮基。然后ChxI作为P450氧化还原酶,它能将C8位上的羟基氧化成酮基,使的C9位上的电子云密度增高,从而攻击C14位,发生亲核反应,然后再经烯醇互变,最终形成带苯环的产物Actiphenol,Actiphenol进一步水解就得到了Phenatic acid A。而Cycloheximide的形成就复杂的多,根据之前的发酵实验中断掉chxG和chxH后,就只产Actiphenol不产Cycloheximide,说明Cycloheximide的形成还需要这两个酶的参与,ChxG功能为NADH-黄素依赖的氧化还原酶,在这个推测的生物合成途径中,它可能起俩个作用,首先是将C12和C13之间的双键还原,导致成环后就不能形成苯环,接着再成环后C14和C9之间的双键还原,再经烯醇互变最终形成ChxH这个酮基还原酶的前体物质Cycloheximide H1。而ChxH作为NADPH依赖的酮基还原酶,就能将Cycloheximide H1的C8位上的酮基还原成羟基,再经烯醇互变成最终的产物Cycloheximide。最终推测得到Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径。此次实验首次提供了为什么一个基因簇能产生放线菌酮(带环己烷基团)和放线菌酚(带苯环基团)的假设,为以后此类化合物的生物合成途径推测提供了参考。同时放线菌酮和放线菌酚基因簇的获得及序列分析发现其为AT-less I类聚酮合酶,为这一戊二酰亚胺类化合物家族的研究增加了一个基因簇结构更简单的对象。对今后TE的重置,戊二酰亚胺的形成等研究提供参考。接着我们又对Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径中相关蛋白进行了体外实验,克隆表达其生物合成途径中最后一步酮基还原酶ChxH,成功得到有活性的蛋白,并优化得到ChxH蛋白反应条件,通过一系列底物的反应,初步获得ChxH酶对底物的选择性结果,同时进行了对天然底物cycloheximide H1及相应逆反应底物cycloheximide的酶活动力学分析,发现在NADPH饱和的情况下,以不同浓度Cycloheximide H1为底物,获得的酶最大反应速度Vmax和在Cycloheximide H1饱和的情况下,不同浓度NADPH下获得的酶最大反应速度Vmax差不多,从而印证了数据的可靠性。而且在比较Cycloheximide H1为底物和以Cycloheximide为底物的酶活参数时,我们发现Km值, Cycloheximide H1更低,说明ChxH与Cycloheximide H1的结合能力更好, Cycloheximide H1的转换数(kcat)是Cycloheximide的1.48倍,催化效率(kcat/Km)是3.36倍,说明Chx还原Cycloheximide H1成Cycloheximide的能力比氧化Cycloheximide成Cycloheximide H1要强的多,这也从生物合成途径说明为什么Cycloheximide是最终的产物的原因。同时通过模型构建我们也推测了ChxH的还原反应机制。基因簇的异源表达是研究基因簇的功能,也是未来组合生物学发展的一个重要基础。通过一个基因簇成功的在异源宿主中表达,就有可能提高相应化合物的产量,也有可能通过基因簇聚酮合酶模块的改造或后修饰基因的变化,从而得到一些新化合物。本次实验我们成功的构建了放线菌酮和放线菌酚的生物合成基因簇的异源表达载体,并通过导入chxA基因。在异源表达菌株S. lividans K4-114中成功表达了放线菌酮和放线菌酚的生物合成蛋白,通过对发酵产物的HPLC分析,发现了放线菌酮但没看到放线菌酚。说明异源表达的复杂性,相关结果还得进一步的实验验证。但初步获得的结果为以后异源表达或者组合生物合成新的戊二酰亚胺类化合物奠定基础。接着我们又通过分析iso-MGS基因簇,LTM基因簇及CHX基因簇,发现mgsA基因及它的同源基因chxA在MGS和CHX基因簇中分别存在,但在LTM基因簇中却没有;在之前的实验中,mgsA基因的失活彻底丧失了iso-MGS的产生;通过把iso-MGS基因簇转化到不同的异源表达菌株,并对基因簇中的各个基因进行RT-PCR监测,发现mgsA几乎并不转录。而这些发现对弄清楚天然产物的基因簇在异源体系中是如何表达就显的很重要。因此我们成功构建了chxA和mgsA调控基因的表达质粒pUWL201PW-chxA,pKC1139-chxA,pUWL201PW-mgsA,pKC1139-mgsA;并分别导入相应的异源表达宿主及野生型菌株中,并通过对得到的工程菌株的发酵产物的HPLC分析,发现mgsA对iso-MGS表达菌株的产量提高有限,在20%-96%之间,说明mgsA对iso-MGS基因簇的调控并不明显,可能是由于iso-MGS基因簇本身就含有mgsA,增加的拷贝对基因簇的调控没有叠加效应。对Lactimidomycin表达菌株,mgsA的引入导致Lactimidomycin基因簇的沉默,但同时也有可能激活了其它代谢产物的产生。而chxA则使得Lactimidomycin的产量提高了近一倍。由于iso-MGS,LTM,CHX这三个基因簇的相关性,这一现象的发现对研究这一类化合物的调控提供了重要线索,但还得后续的实验,如新产物的分离鉴定,chxA和mgsA的RT-PCR验证等来进一步的证实。本研究成功获得了冰城链霉菌的基因组,并对整个基因组结构进行了分析和比较,推测得到米尔贝霉素的生物合成基因簇及其他相关次级代谢产物的基因簇,为以后对冰城链霉菌的研究打下基础。同时通过一系列分子生物学手段,如基因中断,互补等实验推测得到戊二酰亚胺聚酮类化合物Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径,并成功构建了异源表达体系,并对戊二酰亚胺聚酮类化合物家族的相关调控基因chxA和mgsA进行了研究,为以后此类化合物的研究奠定了基础。

姜春艳[9](2013)在《聚醚类抗生素盐霉素的生物合成机制》文中认为盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌产生的聚醚类抗生素,作为球虫抑制药和生长促进剂被广泛地应用于畜牧业和家禽饲养业。最新研究发现盐霉素能够高效抑制上皮肿瘤肝细胞的生长。但是前期盐霉素生物合成的研究仅停滞于同位素标记的前体的喂养实验。通过大片段缺失实验,我们发现之前文献报道的4.5-kb盐霉素基因簇序列与盐霉素的生物合成并不相关。随后,我们根据目前报道的聚醚类抗生素生物合成基因簇中的关键酶环氧化酶的高度保守性,基于CODEHOP和PaBaliS原理首次设计并成功筛选到适于挖掘潜在的聚醚类抗生素基因簇的简并性引物。利用这对简并性引物,我们在白色链霉菌XM211的基因组中克隆到了可能与盐霉素生物合成相关的环氧化酶基因slnC。通过分析slnC基因置换突变株JCY16及其回补株的发酵产物,我们确定slnC是盐霉素生物合成所必需的。最终,我们通过染色体步移获得了127-kb的DNA区域,进一步序列测定和分析发现其中包括I型聚酮合酶基因、环氧化酶基因、环氧水解酶基因、细胞色素P450单氧化酶基因以及调节、转运基因等。通过序列分析我们也推测了盐霉素各聚酮合酶(SlnA1-A9)中的模块和结构域组成。由于模块14和模块6的结构域组成中均缺少脱水酶(DH)结构域,所以合成的盐霉素聚酮链在C3及C19为羟基结构,而并不是预测的C2-C3位(与该位置四氢呋喃环形成相关)和C18-C19位双键。我们初步推测这两步脱水反应是由独立的脱水酶催化完成,但在克隆的127-kb序列中我们并未发现脱水酶基因。这两个位置的双键形成原因成为一个令人困惑而又值得深究的问题。盐霉素生物合成基因簇的核心区域含有一个甲基转移酶基因slnM,其编码的蛋白与羧甲基转移酶TcmP具有较高的同源性。但盐霉素生物合成推测没有任何甲基化反应且HPLC-MS检测白色链霉菌XM211的发酵产物中并不含有盐霉素甲基化衍生物。有趣的是,体内失活和回补实验表明slnM是盐霉素生物合成的必需基因,且slnM突变株积累了一个新的化合物1。核磁共振谱显示化合物1是盐霉素的结构类似物,不同之处在于C19位为羟基,C17-C18为双键结构,并且化合物1中三元螺环尚未形成,为二元螺环结构。将化合物1喂养到丧失盐霉素产生能力但含有完整的slnM基因的突变株中,发酵结果显示部分化合物1被转化为盐霉素,说明1可能是盐霉素生物合成的中间产物。在大肠杆菌中异源表达的SlnM能够催化化合物1转化为盐霉素,表明SlnM催化了盐霉素生物合成的最后一步反应,即负责C18-C19位双键和三元螺环的同时形成。通过监测S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在反应体系中的浓度,我们发现SAM在反应中并不被消耗。进一步的实验结果表明甲基化抑制剂sinefungin(SAM的结构类似物)能够替代SAM作为SlnM催化反应的辅因子。我们还发现化合物1中C1位羧基被甲酯化封闭后得到的化合物不能被SlnM催化利用。根据这些实验结果,我们推断了SlnM的反应机理,即SAM或sinefungin通过静电作用使化合物1稳定的处于类似于盐霉素的构型,有利于SlnM中的活性氨基酸催化C18-C19位双键的形成和三元螺环的形成,得到盐霉素。SlnM的发现不但扩展了我们对SAM在生化反应中作用的认识,而且揭示了聚酮类化合物中双键形成的一类新机制。为了探索盐霉素的生物合成机制,我们通过基因置换手段对基因簇中另外12个基因进行了失活。突变株发酵产物经HPLC-MS检测显示,其中5个基因是盐霉素生物合成的必需基因,可能参与盐霉素聚酮链释放(slnBI)、PKS后修饰(slnF)、环氧化水解(slnBII、slnBIII)以及正调控(slnR)等;另外5个基因与盐霉素的生物合成相关但并非必需基因,可能与四碳前体的合成(orf11、orf12)、聚酮链延伸过程非正常底物的清除(slnDII)以及调控(orf15、orf16)等相关。与其它已报道的聚醚类抗生素基因簇不同,盐霉素生物合成基因簇中包含三个环氧水解酶基因:slnBI、slnBII、slnBIII。slnBII和slnBIII突变株都丧失了盐霉素产生能力,积累了两个新的化合物A和B,暗示SlnBII和SlnBIII与环氧水解的级联反应相关。而slnBI突变株中盐霉素产量不到野生型产量的5%,暗示SlnBI可能与盐霉素聚酮链的释放相关。盐霉素生物合成基因簇的克隆与基因功能分析为探明盐霉素的生物合成机理提供了可能,这不但扩大了我们对聚醚类抗生素生物合成的认识,并且为定向设计具有更高活性的盐霉素衍生物和提高盐霉素产量奠定了基础。

刘倩[10](2012)在《杀粉蝶菌素A1的生物合成研究》文中进行了进一步梳理杀粉蝶菌素A1(Piericidin A1)是具有良好生物活性的-吡啶酮天然产物,可由多种链霉菌产生。它通过结合线粒体呼吸作用复合体I,抑制Fe-S簇氧化和泛醌的还原,从而作为线粒体呼吸作用抑制剂发挥作用。由于这一作用机理,杀粉蝶菌素A1对致病真菌显示较强的生物活性,但对微生物、植物致病菌抗菌活性相对较弱。此外,对蚕、菜青虫有很显着的杀虫效果。最近新的研究进展表明,杀粉蝶菌素A1还有抑制肿瘤的效果。上世纪七十年代,通过同位素前体的喂养发现碳骨架来自乙酸盐和丙酸盐单位,而与已知的其他-吡啶酮天然产物都是通过杂合PKS-NRPS合成显示出显着不同。本课题出发菌株是由浙江省农科院筛选的票霉素链霉菌杭州湾变种,是拥有我国自主知识产权的微生物资源。前期通过诱变育种得到的突变株,可产生具有较高杀虫活性的杀粉蝶菌素衍生物,但精确结构尚未确定。本研究首先对该菌株的次级代谢产物进行发酵和分离,并对活性成分进行结构鉴定,确定其结构为杀粉蝶菌素A1。此外,优化产生菌的产孢条件和接合转移条件,建立了遗传操作系统,为通过体内遗传学研究杀粉蝶菌素A1生物合成机理奠定了基础。通过Roche454高通量测序平台,对票霉素链霉菌杭州湾变种进行了基因组扫描,捕获了杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇。并对17kb区域进行大片段缺失,证实了与杀粉蝶菌素A1生物合成相关。进一步通过染色体步移和拼接(引物设计补gap),获得与杀粉蝶菌素A1的生物合成相关的长达130kb的序列。对这130kb的序列进行生物信息学分析,确定杀粉蝶菌素A1的生物合成途径包含12个基因,编码1个调控蛋白PieR、6个聚酮合酶PieA1-PieA6、1个转氨酶PieD、1个功能未知蛋白PieC、2个甲基转移酶PieB1和PieB2和1个单加氧酶PieE。以所包含的功能信息为依据,对这些蛋白功能进行了深入分析,推测杀粉蝶菌素A1的生物合成是由聚酮合酶、转氨酶和其它未知功能蛋白参与形成核心结构-吡啶环,由甲基转移酶和单加氧酶完成后修饰步骤,调控基因行使杀粉蝶菌素A1生物合成的特异性调控。随后,对参与杀粉蝶菌素A1核心结构-吡啶环生物合成的基因,pieTE、pieC和pieD基因进行了体内基因置换,并对获得的相应突变株进行了发酵检测。pieD、pieC、pieTE基因中断突变株发酵产物中都没有检测到中间产物的积累,一种原因可能是这类小分子的中间物没有特征的紫外吸收,很难检测;另外一种可能是这类中间物在体内复杂环境中被降解了。通过组合多种体外生物化学分析方法,研究了PieA6中的module8-TE的作用,确定了PieTE的水解功能。首先表达了重组蛋白module8-TE及点突变株module8-TE0(S148A),加入β-ketoacyl-SNAC和malonyl-CoA,经过一轮PKS的延伸缩合,产生β,-diketoacyl-S-ACP8。通过检测到的β,-diketo carboxylic acid脱羧后产生的undecane-2,4-dione,及fluoresceinamine偶联实验中产生的新峰对应于3,5-dioxododecanoicacid的偶联产物,证明PieTE是负责水解释放β,-diketoacyl-S-ACP8成线性β,-diketo carboxylic acid。此外,用DTNB试剂检测了PieTE水解SNAC模拟底物的水解能力,证实PieTE结构域可以水解β-ketoacyl-SNAC,并且对长碳链的底物具有偏好性,对短链的模拟底物基本无水解活性。当定点突变失活PieTE,使用module8-TE0(S148A)进行同样的体外催化反应时,发现天然底物β,-diketoacyl-S-ACP8很容易自发环化形成-吡喃酮。基于上述体内基因置换及体外模拟底物生物化学分析,发现了一种新的-吡啶环生物合成途径并初步阐明了杀粉蝶菌素A1的生物合成途径。I型PKS模块以典型的流水线装配模式组装成聚酮骨架,并被PKS C-端的PieTE直接水解释放生成线性聚酮链,PieD以游离氨为氨基供体,对聚酮链末端的羧基转氨,进而可能由PieC参与环化反应,形成核心结构-吡啶环。实验结果表明,由于PieTE可以高效地直接水解释放线状聚酮酸,所以避免了β,-diketoacyl-S-ACP8自发环化成-吡喃酮。与已报道的其他-吡啶酮类天然产物通过PKS-NRPS途径加载氨基酸单元而引入氮原子不同,证实杀粉蝶菌素A1的生物合成中具有一个新的-吡啶环合成途径。在杀粉蝶菌素A1的生物合成过程中,不是由氨基酸提供-吡啶酮上的氨基供体,而且需要PieTE高效催化水解将不稳定的β,-diketoacyl-S-ACP8释放,进一步以游离氮为氨基供体进行转氨环化,形成-吡啶酮。通过体内基因置换,失活了生物合成基因簇中的三个修饰基因pieB1、pieB2和pieE。初步分析鉴定了突变株积累的中间物,已成功的对pieB2的目标中间物通过大规模发酵,积累了5mg纯品,准备进行NMR结构鉴定;构建了在大肠杆菌中异源表达PieB1、PieB2、PieE重组蛋白的表达载体。这部分实验初步阐述了杀粉蝶菌素A1生物合成途径中形成-吡啶酮核心结构后,三步修饰过程发生的先后顺序,为进一步研究这三个后修饰基因功能奠定了基础。此外,利用生物信息学工具,深入分析基因组序列,发现该菌株还包含丰富的其他多种次级代谢产物的生物合成信息,如PKS、NRPS、杂合NRPS-PKS、aminoglycoside、terpene、siderophore、lantibiotic等,为后期挖掘该菌株丰富的次级代谢产物资源提供基因序列的支持。

二、南昌链霉菌中南昌霉素生物合成基因簇的克隆分析及其药物创新潜力(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、南昌链霉菌中南昌霉素生物合成基因簇的克隆分析及其药物创新潜力(论文提纲范文)

(1)冰城链霉菌米尔贝霉素高产菌株的工程改造 ——基于次级代谢物生物合成基因簇关系解析(论文提纲范文)

内容摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 链霉菌及次级代谢物合成
        1.1.1 链霉菌源的次级代谢物
        1.1.2 次级代谢物生物合成的调控
    1.2 链霉菌次级代谢物高产的工程改造
        1.2.1 基于次级代谢簇前体竞争的工程改造
        1.2.2 基于调控基因的工程改造
    1.3 冰城链霉菌及米尔贝霉素研究概况
        1.3.1 冰城链霉菌的次级代谢产物
        1.3.2 米尔贝霉素的特征及应用
        1.3.3 米尔贝霉素的生物合成
        1.3.4 米尔贝霉素生物合成的调控
2 实验材料
    2.1 菌株及质粒
    2.2 试剂及仪器
        2.2.1 培养基及溶液的配制
        2.2.2 引物与酶等生化试剂
        2.2.3 主要仪器及设备
3 实验方法
    3.1 菌种的培养与保藏
    3.2 载体及重组菌构建相关的操作
    3.3 属间接合转移
    3.4 链霉菌RNA的提取、反转录及荧光定量PCR检测
    3.5 外源蛋白的表达及纯化
    3.6 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳
    3.7 蛋白质凝胶阻滞实验(EMSA)
    3.8 转录组测序
    3.9 代谢物的检测
        3.9.1 发酵液菌体浓度测定
        3.9.2 米尔贝霉素的检测
        3.9.3 酰基辅酶A含量的检测
4 结果与分析
    4.1 冰城链霉菌中次级代谢物合成基因簇的共表达分析
        4.1.1 基于时序转录谱数据的层次聚类分析
        4.1.2 共表达的Ⅱ型聚酮合成酶基因簇kel
        4.1.3 敲除kel基因对米尔贝霉素合成的影响
    4.2 米尔贝霉素及黄色化合物合成的代谢竞争
        4.2.1 Ⅱ型聚酮合成酶基因簇kel负责未知黄色化合物KEL的合成
        4.2.2 阻断KEL的合成对米尔贝霉素合成前体的影响
        4.2.3 阻断KEL的合成对米尔贝霉素合成的影响
    4.3 基于KelR调控的米尔贝霉素及黄绿色化合物合成的共激活
        4.3.1 转录因子KelR的信息分析
        4.3.2 kelR敲除对米尔贝霉素及黄色化合物KEL合成的影响
        4.3.3 kelR敲除对mil簇及kel簇内基因转录水平的影响
        4.3.4 kel簇内共转录单元的分析
        4.3.5 KelR调控靶基因的确定
        4.3.6 异源宿主中KelR对靶基因转录的激活
    4.4 联合合成酶基因敲除及kelR过表达对米尔贝霉素合成的影响
        4.4.1 kelR过表达对米尔贝霉素生物合成的影响
        4.4.2 kelR过表达对米尔贝霉素合成基因转录水平的影响
        4.4.3 kelR过表达对黄色化合物合成基因转录水平的影响
        4.4.4 组合合成酶基因敲除及kelR过表达对米尔贝霉素产量的影响
    4.5 其他共表达次级代谢基因簇与mil基因簇的关系
        4.5.1 另外两个基因簇与米尔贝霉素合成基因簇共表达
        4.5.2 KelR对两个共表达基因簇的调控作用
        4.5.3 敲除核心合成酶基因对米尔贝霉素产量的影响
    4.6 米尔贝霉素高产菌的工程改造
        4.6.1 共表达基因簇在高产菌株BC04中的转录水平
        4.6.2 高产菌株的构建
5 讨论
6 结论
致谢
参考文献
博士后个人简历
攻读博士学位期间发表的学术论文
博士后期间的工作成果

(2)基于大片段克隆技术的罗中链霉菌TRM49605次生代谢产物基因簇挖掘(论文提纲范文)

缩略词表
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 链霉菌是活性产物的重要来源
        1.1.1 陆地链霉菌活性物质
        1.1.2 海洋链霉菌活性物质
    1.2 基因组信息导向的基因簇挖掘策略
        1.2.1 链霉菌基因组特征
        1.2.2 后基因组时代的基因簇挖掘
    1.3 本文设计思路
        1.3.1 研究目的及意义
        1.3.2 技术路线
第2章 罗中链霉菌次级代谢潜力分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株来源
        2.1.2 生物信息学分析工具
    2.2 实验方法
        2.2.1 基因组测序
        2.2.2 生物合成基因簇分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 罗中链霉菌次级代谢产物合成潜力分析
        2.3.2 衣霉素基因簇Cluster24基因功能预测
        2.3.3 Cluster17基因功能预测
        2.3.4 Cluster36基因功能预测
    2.4 小结与讨论
第3章 衣霉素基因簇Cluster24的克隆及鉴定
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要抗生素
        3.1.2 菌株及质粒
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要培养基
        3.1.5 基因测序及引物序列
        3.1.6 主要试剂
        3.1.7 生物信息学分析工具
    3.2 实验方法
        3.2.1 Cluster24异源表达实验设计
        3.2.2 链霉菌总DNA提取
        3.2.3 质粒DNA提取
        3.2.4 Red/ET重组克隆PCR反应体系
        3.2.5 基因簇酶切回收
        3.2.6 T4 DNA Polymerase反应体系
        3.2.7 Red/ET电转化方案
        3.2.8 pTRM6052401 质粒构建
        3.2.9 pTRM6052402 质粒构建
        3.2.10 pTRM6052403 质粒构建
        3.2.11 属间接合转移
        3.2.12 链霉菌重组菌发酵
        3.2.13 发酵产物提取及检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 pTRM6052401 酶切鉴定
        3.3.2 pTRM6052402 酶切鉴定
        3.3.3 pTRM6052403 酶切鉴定
        3.3.4 pTRM6052403 属间接合转移
        3.3.5 Cluster24异源表达产物分析
    3.4 小结与讨论
第4章 Cluster17基因簇的克隆及鉴定
    4.1 实验材料
        4.1.1 基因测序及引物合成
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 主要培养基
        4.1.4 菌株及质粒
        4.1.5 主要抗生素
        4.1.6 主要试剂
        4.1.7 生物信息学分析工具
    4.2 实验方法
        4.2.1 Cluster17异源表达实验设计
        4.2.2 pTRM6051701 质粒构建
        4.2.3 pTRM6051702 质粒构建
        4.2.4 属间接合转移
        4.2.5 链霉菌重组菌发酵
        4.2.6 发酵产物提取及检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 pTRM6051701 酶切鉴定
        4.3.2 pTRM6051702 酶切鉴定
        4.3.3 pTRM6051702 属间接合转移
        4.3.4 Cluster17异源表达产物分析
    4.4 小结与讨论
第5章 Cluster36基因簇的克隆及鉴定
    5.1 实验材料
        5.1.1 基因测序及引物序列
        5.1.2 菌株与质粒
        5.1.3 主要仪器
        5.1.4 主要培养基
        5.1.5 主要抗生素
        5.1.6 主要试剂
        5.1.7 生物信息学分析工具
    5.2 实验方法
        5.2.1 Cluster36异源表达实验设计
        5.2.2 pTRM6053601质粒构建
        5.2.3 pTRM6053602质粒构建
        5.2.4 属间接合转移
        5.2.5 链霉菌重组菌发酵
        5.2.6 发酵产物提取及检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 pTRM6053601酶切验证
        5.3.2 pTRM6053602酶切验证
        5.3.3 pTRM6053602属间接合转移
        5.3.4 Cluster36异源表达产物分析
    5.4 小结与讨论
第6章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
参考文献
致谢
作者简介

(3)内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征及wblA基因的调控功能(论文提纲范文)

摘要
Abstract
1 引言
    1.1 链霉菌的开发应用
        1.1.1 链霉菌属(Streptomyces)及其应用
        1.1.2 链霉菌天然产物发现策略
        1.1.3 链霉菌基因工程操作技术
    1.2 链霉菌调控基因
        1.2.1 调控基因的分类
        1.2.2 常见的调控基因
        1.2.3 多效性负调控基因wbIA
    1.3 荧光定量PCR技术
        1.3.1 荧光定量PCR内参基因
        1.3.2 内参基因选择工具及其应用
        1.3.3 常用的链霉菌内参基因
    1.4 本课题研究意义、主要内容及技术路线
        1.4.1 研究意义
        1.4.2 研究内容
        1.4.3 技术路线
2 高抑菌活性生防菌株的筛选与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试菌株和指示菌
        2.1.2 试验苗木
        2.1.3 培养基
        2.1.4 主要试剂和仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 拮抗内生菌初筛及抑菌谱的检测
        2.2.2 发酵液抑菌活性的检测
        2.2.3 拮抗菌株鉴定
        2.2.4 生防实验
    2.3 结果
        2.3.1 拮抗菌株筛选及抑菌谱检测
        2.3.2 菌株鉴定
        2.3.3 不同发酵培养基对MRSA抑菌活性的影响
        2.3.4 离体枝条实验
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 SAT1次级代谢基因簇分析及活性物质的检测
    3.1 实验材料
        3.1.1 培养基
        3.1.2 实验试剂和仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 活性物质的萃取
        3.2.2 TLC法检测目标抗生素
        3.2.3 HPLC法检测目标抗生素
        3.2.4 生物信息学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Streptomyces sp. SAT1次级代谢产物预测
        3.3.2 SAT1发酵液中活性物质的萃取
        3.3.3 TLC和HPLC法检测目标抗生素
        3.3.4 Cluster 24和25的同源性比较分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 wblA表达载体的构建及其对SAT1形态及抑菌活性的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试菌株和质粒
        4.1.2 引物合成及测序
        4.1.3 试剂、试剂盒和主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 质粒DNA和链霉菌基因组DNA的提取
        4.2.2 PCR反应条件
        4.2.3 DNA片段的纯化、酶切和连接反应
        4.2.4 甘油法制备感受态细胞和电转化
        4.2.5 大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移
        4.2.6 突变株的验证及其表型特征和抑菌活性的变化
    4.3 结果与分析
        4.3.1 wblA表达载体的构建和突变株的获得
        4.3.2 突变株遗传稳定性和表型特征
        4.3.3 突变株抑菌能力的变化
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 荧光定量PCR检测wblA对目标基因簇表达量的影响
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 试剂盒
        5.1.3 引物
        5.1.4 实验仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 样品准备
        5.2.2 总RNA提取和qPCR
        5.2.3 数据处理与分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 候选内参基因引物的扩增效率及特异性
        5.3.2 内参基因稳定性评估
        5.3.3 目的基因表达量分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 结论与展望
    6.1 创新点
    6.2 结沦
    6.3 展望
参考文献
个人简介
导师简介
致谢

(4)罗布泊嗜(耐)盐放线菌的物种多样性、抗生素合成基因以及盐胁迫响应机理初探(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 嗜盐放线菌概述
    1.2 嗜(耐)盐放线菌概述
        1.2.1 嗜(耐)盐放线菌定义
        1.2.2 嗜盐放线菌的生理学研究
        1.2.3 嗜盐放线菌的应用价值
    1.3 嗜(耐)盐放线菌物种多样性的研究
        1.3.1 嗜(耐)盐放线菌生物多样性的研究方法
        1.3.2 嗜(耐)盐放线菌的多相分类研究进展
        1.3.3 嗜(耐)盐放线菌生物多样性的研究现状
    1.4 嗜(耐)盐放线菌生物活性多样性
        1.4.1 嗜(耐)盐放线菌生物活性研究现状
        1.4.2 嗜(耐)盐放线菌生物活性物质研究现状
    1.5 嗜(耐)盐放线菌抗生素功能基因研究概况
    1.6 嗜(耐)盐放线菌嗜盐机制的研究现状
    1.7 新疆罗布泊嗜(耐)盐放线菌资源概况
        1.7.1 罗布泊地区简介
        1.7.2 罗布泊地区嗜盐放线菌研究现状
    1.8 研究目的和研究意义
    1.9 技术路线
第二章 罗布泊及其周边盐碱土可培养嗜(耐)盐放线菌物种多样性分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试土样
        2.1.2 分离培养基
        2.1.3 主要实验仪器及试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的分离与纯化
        2.2.2 16S r RNA基因PCR扩增和系统进化分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 罗布泊可培养嗜(耐)盐放线菌物种多样性
        2.3.2 罗布泊周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌物种多样性
        2.3.3 罗布泊与周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌物种多样性的比较
    2.4 讨论
第三章 潜在新物种的多相分类研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试菌株
        3.1.2 主要实验仪器及试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 放线菌基因组DNA的提取
        3.2.2 放线菌 16S r DNA基因的PCR扩增
        3.2.3 生理生化特征
        3.2.4 形态特征描述
        3.2.5 细胞化学组分分析
        3.2.6 系统发育分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 糖多孢菌属(Saccharopolyspora)新物种TRM 45123 多相分类鉴定
        3.3.2 糖霉菌属(Glycomyces)新物种TRM 45387、TRM 45198 和TRM 45127 多相分类
        3.3.3 盐多孢菌属(Halopolyspora)新物种TRM 45668 和TRM 45658 多相分类
    3.4 讨论
第四章 罗布泊及周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌抗生素合成基因多样性分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试菌株
        4.1.2 主要实验仪器及试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 基因组DNA的提取
        4.2.2 抗生素基因的PCR扩增
        4.2.3 PCR产物回收
        4.2.4 放线菌中抗生素合成基因的克隆
    4.3 结果与分析
        4.3.1 罗布泊及其周边盐碱环境土壤嗜(耐)盐放线菌抗生素合成基因分布
        4.3.2 罗布泊及其周边盐碱环境嗜(耐)盐放线菌抗生素合成基因多样性
    4.4 讨论
第五章 罗布泊及其周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌活性菌株的筛选及评价
    5.1 实验材料
        5.1.1 供试菌株
        5.1.2 培养基
        5.1.3 抗菌筛选指示菌
        5.1.4 主要实验仪器及试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 抗菌活性菌株初筛
        5.2.2 抗菌活性菌株复筛
    5.3 结果与分析
        5.3.1 抗菌活性菌株初筛
        5.3.2 抗菌活性菌株的复筛
    5.4 讨论
第六章 6株活性放线菌次级代谢产物的分离与鉴定
    6.1 实验材料
        6.1.1 菌株信息
        6.1.2 培养基
        6.1.3 主要实验仪器及试剂
    6.2 实验方法
        6.2.1 接种及发酵
        6.2.2 发酵产物初步分离
        6.2.3 发酵产物的柱层析分离
        6.2.4 发酵液提取物中化合物的进一步分离纯化
        6.2.5 各菌株次级代谢产物分离流程图
        6.2.6 单体化合物的结构鉴定
    6.3 结果与分析
        6.3.1 次级代谢产物的分离
        6.3.2 化合物结构鉴定
    6.4 讨论
第七章 嗜盐放线菌TRM 45611 嗜盐机制的研究
    7.1 实验材料
        7.1.1 实验菌株
        7.1.2 主要实验仪器
    7.2 实验方法
        7.1.1 菌株TRM 45611 培养及样品的制备
        7.1.2 菌株TRM 45611 转录组测序及分析
    7.3 结果与分析
        7.3.1 菌株TRM 45611 生长曲线及耐盐性测定结果
        7.3.2 菌株TRM 45611 转录组测序概况
    7.4 讨论
总结与展望
    本研究工作总结
    展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的论文
致谢

(6)井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一篇 “弱化初级代谢提高抗生素产量”的改造策略
    第一章 文献综述
        1.1 井冈霉素的研究现状
        1.1.1 井冈霉素的生物合成研究进展
        1.1.2 井冈霉素的发酵工程研究进展
        1.1.3 井冈霉素产生菌组学研究进展
        1.2 放线菌高产菌株代谢工程改造概述
        1.2.1 阿维菌素高产菌株代谢工程改造
        1.2.2 红霉素高产菌株代谢工程改造
        1.2.3 匹马霉素高产菌株代谢工程改造
        1.2.4 克拉维酸高产菌株代谢工程改造
        1.2.5 林可霉素高产菌株代谢工程改造
        1.3 研究的内容和目的
        1.3.1 研究内容
        1.3.2 研究目的
    第二章 实验材料与方法
        2.1 研究中所用菌株
        2.2 研究中所用质粒
        2.3 研究中所用引物
        2.4 研究中所用培养基
        2.5 研究中所用试剂和缓冲液
        2.6 实验方法
    第三章 “弱化初级代谢提高抗生素产量”假说的提出和验证
        3.1 前言
        3.2 结果与讨论
        3.2.1 三个大片段缺失起关键贡献
        3.2.2 大片段缺失突变株产量和生物量变化呈负相关
        3.2.3 Det-Ⅰ 和 Det-Ⅲ 区域关键基因的鉴定
        3.2.4 大片段缺失突变株代谢物组分析
        3.2.55008 及TL01 的定向高产改造
        3.3 小结
    第四章 多种抗生素产生菌株初级代谢的弱化改造
        4.1 前言
        4.2 结果与讨论
        4.2.1 红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 改造
        4.2.2 林可霉素产生菌Streptomyces lincolnensis LC-G改造
        4.2.3 庆大霉素产生菌Micromonospora echinospora ATCC15838 改造
        4.2.4 阿维菌素产生菌Streptomyces avermitilis76-5 改造
        4.3 小结
    第五章 链霉菌线型质粒pSHJG1 的功能研究
        5.1 前言
        5.2 结果与讨论
        5.2.1 TL01 中线型质粒pSHJG1 整体呈现低表达
        5.2.2 线型质粒消除策略的建立和完善
        5.2.3 线型质粒消除提高井冈霉素产量
        5.2.4 线型质粒pSHJG1 中关键基因的确认
        5.2.5 线型质粒 p HZ228 消除提高抗生素 FR008/杀念菌素产量
        5.3 小结
第二篇 盐霉素产生菌基因组解析及定向高产改造
    第六章 文献综述
        6.1 盐霉素的研究现状
        6.1.1 盐霉素的生物合成研究进展
        6.1.2 盐霉素的发酵工程研究进展
        6.2 PKS常用辅酶A类前体研究现状
        6.2.1 丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)
        6.2.2 甲基丙二酰辅酶A((2S)-methylmalonyl-CoA)
        6.2.3 乙基丙二酰辅酶A((2S)-ethylmalonyl-CoA)
        6.2.4 氯代乙基丙二酰辅酶A(chloroethylmalonyl-CoA)
        6.2.5 其他辅酶A类前体
        6.3 研究内容
        6.3.1 研究内容
    第七章 实验材料与方法
        7.1 研究中所用菌株
        7.2 研究中所用质粒
        7.3 研究中所用引物
        7.4 研究中所用培养基
        7.5 实验方法
    第八章 白色链霉菌DSM41398 基因组完整图谱构建和解析
        8.1 前言
        8.2 结果与讨论
        8.2.1 S.albus DSM41398 全基因组完整图谱的构建
        8.2.2 S.albus DSM41398 全基因组的基本特征
        8.2.3 S.albus DSM41398 中次级代谢生物合成基因簇的功能预测
        8.2.4 参与盐霉素合成的前体代谢网络重构
        8.2.5 S.albus DSM41398 豆油利用偏好性研究
        8.3 小结
    第九章 前体浓度微调整促进盐霉素产量提高
        9.1 前言
        9.2 结果与讨论
        9.2.1 PKS生物合成基因簇的生物信息学分析
        9.2.2 PKS生物合成基因簇的转录量分析
        9.2.3 竞争基因簇中断促进产量提高
        9.2.4 组合缺失突变株产量没有进一步的提高
        9.2.5 乙基丙二酰辅酶A的供应是新的限速步骤
        9.2.6 编码巴豆酰辅酶A还原酶基因的鉴定
        9.2.7 超量表达ccr基因促进组合缺失突变株产量进一步提高
        9.2.8 超量表达ccr基因促进高产菌株产量进一步提高
        9.3 小结
第十章 总结与展望
    10.1 总结
    10.2 本研究的创新点
    10.3 工作展望
参考文献
致谢
攻读博士期间的研究成果

(7)淀粉酶产色链霉菌1628合成丰加霉素关键基因的研究(论文提纲范文)

致谢
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 植物病害的分类及其防治手段
        1.1.1 化学防治
        1.1.2 生物防治手段
    1.2 生防链霉菌的研究进展
        1.2.1 链霉菌在生物防治上的应用
        1.2.2 链霉菌合成抗生素的分子机制
        1.2.3 链霉菌的分子生物学改造
    1.3 核苷类抗生素研究概况
        1.3.1 核苷类抗生素简介
        1.3.2 丰加霉素研究现状
    1.4 核糖体再循环因子RRF的研究进展
        1.4.1 RRF的简介
        1.4.2 RRF的结构特点
        1.4.3 RRF的作用机理
        1.4.4 RRF在链霉菌遗传改造中的应用
    1.5 本论文研究的内容及意义
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 研究内容
2 toyG和toyF基因的过量表达对1628丰加霉素产量的影响
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 菌种与质粒
        2.2.2 培养基
        2.2.3 缓冲液
        2.2.4 试剂、工具酶及试剂盒
        2.2.5 引物设计
        2.2.6 主要仪器
    2.3 方法
        2.3.1 toyF和toyG基因的扩增
        2.3.2 割胶回收,连接,测序
        2.3.3 大肠杆菌感受态的制备及DNA的转化
        2.3.4 大肠杆菌质粒DNA的提取
        2.3.5 酶切
        2.3.6 链霉菌总DNA的提取
        2.3.7 接合转移
        2.3.8 S. diastatochromogenes 1628生长曲线的测定
        2.3.9 粗酶液的制备
        2.3.10腺苷酸琥珀酸裂解酶(TOYF)的酶活检测
        2.3.11腺苷酸琥珀酸合成酶(TOYG)的酶活检测
        2.3.12 HPLC检测TM含量
    2.4 结果与分析
        2.4.1 重组质粒pIB139-toyF和pIB139-toyG的构建
        2.4.2 重组菌 1628-TOYF和 1628-TOYG的构建
        2.4.3 重组菌中TOYF和TOYG的酶活检测
        2.4.4 toyF和toyG基因的过量表达对1628的TM产量的影响
        2.4.5 toyF和toyG基因的过量表达对1628菌株生长的影响
    2.5 讨论
3 过量表达核糖体再循环因子RRF对S. diastatochromogenes 1628丰加霉素产量的影响
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 菌种与质粒
        3.2.2 培养基
        3.2.3 试剂、工具酶及试剂盒
        3.2.4 引物设计
        3.2.5 主要仪器
    3.3 方法
        3.3.1 基因frr和PermE*-gfp的PCR扩增
        3.3.2 割胶回收、连接、测序
        3.3.3 大肠杆菌感受态的制备及DNA的转化
        3.3.4 大肠杆菌质粒DNA的提取
        3.3.5 酶切
        3.3.6 链霉菌总DNA的提取
        3.3.7 接合转移
        3.3.8 S. diastatochromogenes 1628生长曲线的测定
        3.3.9 HPLC检测TM含量
        3.3.10链霉菌总RNA的提取
        3.3.11基因表达量的检测
        3.3.12 GFP荧光强度的检测
    3.4 结果与分析
        3.4.1 重组质粒pIB139-frr的构建
        3.4.2 重组菌 1628-FRR的构建、筛选及鉴定
        3.4.3 RRF的过量表达对1628菌株生长状态的影响
        3.4.4 RRF的过量表达对1628菌株TM产量的影响
        3.4.5 RRF的过量表达对结构基因toyF和toyG的转录水平的影响
        3.4.6 重组质粒pIB139-frr-gfp和重组菌 1628-FRG的构建
        3.4.7 过量表达RRF对生长期后期蛋白合成的影响
    3.5 讨论
4 frr、vgb和toyG基因在1628中的联合表达及对丰加霉素产量的影响
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 菌种与质粒
        4.2.2 培养基,主要仪器及试剂
        4.2.3 引物设计
    4.3 方法
        4.3.1 PermE*-toyG、PermE*-frr片段的扩增
        4.3.2 割胶回收,连接,测序
        4.3.3 酶切
        4.3.4 大肠杆菌感受态的制备及转化
        4.3.5 大肠杆菌质粒DNA的提取
        4.3.6 链霉菌总DNA和总RNA的提取
        4.3.7 HPLC检测TM含量
        4.3.8 接合转移
        4.3.9 S.diastatochromogenes 1628生长曲线的测定
        4.3.10粗酶液的制备
        4.3.11腺苷酸琥珀酸合成酶(TOYG)的酶活检测
    4.4 结果与分析
        4.4.1 重组菌S. diastatochromogenes1628-FG和 1628-VG的构建
        4.4.2 toyG、frr基因串联过量表达对1628菌株合成TM的影响
        4.4.3 toyG、vgb基因的串联过量表达在不同限氧条件下表达对1628菌株合成TM的影响
        4.4.4 重组菌S. diastatochromogenes1628-VGF的构建
        4.4.5 重组菌 1628-VGF合成TM能力的测定
    4.5 讨论
5 总结与展望
    5.1 全文总结
    5.2 课题创新
    5.3 课题展望
参考文献
作者简历

(8)冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究(论文提纲范文)

目录
CONTENTS
摘要
Abstract
英文缩略语(Abbreviation)
1 前言
    1.1 链霉菌基因组研究概况
        1.1.1 链霉菌简介
        1.1.2 链霉菌基因组研究概况
    1.2 天然产物对新药研发的重要性
    1.3 戊二酰亚胺聚酮类化合物
    1.4 聚酮类化合物的生物合成
    1.5 AT-less I 类聚酮合酶
    1.6 放线菌酮类化合物的作用机制及最新应用
    1.7 课题来源和研究内容及意义
        1.7.1 课题来源
        1.7.2 研究内容及意义
2 材料和方法
    2.1 冰城链霉菌基因组结构研究
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验方法
    2.2 Cycloheximide 和 Actiphenol 的生物合成机制研究
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验方法
    2.3 Cycloheximide H 脱氢酶的研究
        2.3.1 实验材料
        2.3.2 实验方法
    2.4 Cycloheximide 和 Actiphenol 生物合成基因簇异源表达体系的构建
        2.4.1 实验材料
        2.4.2 实验方法
    2.5 chxA 和 mgsA 调控基因在异源表达宿主及本体中的作用
        2.5.1 实验材料
        2.5.2 实验方法
3 结果与分析
    3.1 冰城链霉菌基因组结构研究
        3.1.1 前言
        3.1.2 冰城链霉菌基因组整体结构
        3.1.3 冰城链霉菌基因组内容与 S.avermitilis, S.coelicolor(A3) and S.griseus 的比较
        3.1.4 冰城链霉菌基因组次级代谢基因簇的预测
    3.2 Cycloheximide 和 Actiphenol 的生物合成机制研究
        3.2.1 前言
        3.2.2 ΔchxI,ΔchxJ,ΔchxG,ΔchxH 基因阻断突变株的筛选鉴定
        3.2.3 ΔchxI,ΔchxJ,ΔchxG,ΔchxH 基因阻断变株的回复
        3.2.4 发酵产物的分析鉴定
        3.2.5 Phenatic acid A 在ΔchxG 突变株发酵过程中的跟踪
        3.2.6 Cycloheximide 和 Actiphenol 的生物合成途径推测
    3.3 Cycloheximide H 脱氢还原酶的功能鉴定
        3.3.1 前言
        3.3.2 底物的合成与鉴定
        3.3.3 ChxH 蛋白的表达及纯化
        3.3.4 确定酶反应所需的条件及辅助因子
        3.3.5 ChxH 的底物选择性
        3.3.6 酶活动力学分析
        3.3.7 ChxH 蛋白同源建模及作用机制预测
    3.4 Cycloheximide 和 Actiphenol 生物合成基因簇异源表达体系的构建
        3.4.1 前言
        3.4.2 pCHX5-152f 异源表达质粒的构建和验证
        3.4.3 异源表达菌株的筛选鉴定
        3.4.4 异源表达菌株发酵产物的分析鉴定
    3.5 chxA 和 mgsA 调控基因在异源表达宿主及本体中的作用
        3.5.1 前言
        3.5.2 chxA 和 mgsA 基因的分析和获取
        3.5.3 载体的选择及构建
        3.5.4 原生质体转化和结合转移及阳性菌株的筛选
        3.5.5 阳性菌株发酵产物的 HPLC 分析
4 结论与建议
致谢
参考文献
附图表
攻读博士学位期间发表的学术论文

(9)聚醚类抗生素盐霉素的生物合成机制(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 天然产物生物合成研究的基本策略
    1.2 聚酮类抗生素的生物合成研究
    1.3 聚醚类抗生素生物合成研究进展
    1.4 盐霉素生物合成研究进展
    1.5 本研究的内容和目的
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
第三章 盐霉素生物合成基因簇的克隆和功能分析
    3.1 前言
    3.2 实验材料
    3.3 白色链霉菌 XM211 遗传操作系统的建立
    3.4 4.5-kb 已报道序列与盐霉素的生物合成不相关
    3.5 盐霉素生物合成基因簇的克隆
    3.6 盐霉素生物合成基因簇的鉴定
    3.7 盐霉素生物合成基因簇的序列测定
    3.8 盐霉素生物合成基因簇中的基因及其编码的蛋白
    3.9 盐霉素生物合成基因簇边界的确定
    3.10 盐霉素生物合成基因簇中聚酮合酶的分析
    本章小结
第四章 O-甲基转移酶 SlnM 的催化功能研究
    4.1 前言
    4.2 实验材料
    4.3 SlnM 的生物信息学分析
    4.4 slnM 基因功能的体内研究
    4.5 化合物 1 的分离纯化和结构鉴定
    4.6 SlnM 功能的定位及体内重现
    4.7 体外实验证明 SlnM 催化化合物 1 转化为盐霉素
    4.8 SlnM 催化机理的研究
    本章小结
第五章 盐霉素生物合成基因簇中其它基因的研究
    5.1 前言
    5.2 实验材料
    5.3 与盐霉素聚酮链释放相关的候选基因
    5.4 slnDI 与盐霉素的生物合成无关
    5.5 slnDII 与盐霉素的生物合成相关
    5.6 orf18 与盐霉素的生物合成相关
    5.7 slnBI 与盐霉素的生物合成相关
    5.8 基因 slnBII 和 slnBIII 的功能研究
    5.9 基因 slnF 的功能研究
    5.10 基因 slnR 的功能研究
    5.11 修正后的盐霉素生物合成途径推测
    本章小结
第六章 总结与展望
参考文献
致谢
学术论文和科研成果
附件

(10)杀粉蝶菌素A1的生物合成研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
    1.1 天然产物生物合成的研究概况与发展
    1.2 PKS和NRPS类天然产物生物合成研究
    1.3 -吡啶酮类天然产物生物合成研究
第二章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
第三章 S. piomogeues var. Hangzhouwanensis杀粉蝶菌素A1的结构鉴定及产生菌遗传操作系统的建立
    3.1 前言
    3.2 杀粉蝶菌素A1的结构鉴定
    3.3 产生菌遗传操作体系的建立
    3.4 本章小结
第四章 杀粉蝶菌素 A1 的生物合成基因簇的克隆
    4.1 前言
    4.2 产生菌基因组文库的构建
    4.3 根据I型PKS的KS结构域设计简并引物克隆基因簇
    4.4 根据基因组扫描序列克隆基因簇
    4.5 本章小结
第五章 杀粉蝶菌素 A1 生物合成基因簇的基因功能分析及生物合成途径的推测
    5.1 前言
    5.2 生物合成基因簇中 12 个基因的功能分析
    5.3 生物合成途径推测
    5.4 本章小结
第六章 杀粉蝶菌素 A1 核心结构α-吡啶酮生物合成途径推测
    6.1 前言
    6.2 体内实验中断pieC,pieD,pieA6-TE
    6.3 体外实验对pieA6-TE功能的研究
    6.4 体外对PieC,PieD重组蛋白表达
    6.5 本章小结
第七章 杀粉蝶菌素 A1 后修饰步骤探索
    7.1 前言
    7.2 体内实验中断pieB1,pieB2,pieE
    7.3 体外对PieB1,PieB2,PieE重组蛋白的表达
    7.4 本章小结
第八章 S. piomogeues var. Hangzhouwanensis基因组扫描序列的挖掘
    8.1 前言
    8.2 基因组扫描序列中的PKS
    8.3 基因组扫描序列中的NRPS
    8.4 基因组扫描序列中的NRPS-PKS
    8.5 基因组扫描序列中的Aminoglycoside
    8.6 基因组扫描序列中的Terpene
    8.7 基因组扫描序列中的Siderophore
    8.8 基因组扫描序列中的Lantibiotic
    8.9 本章小结
第九章 总结与展望
    9.1 本研究工作总结及主要创新点
    9.2 本研究工作展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间已发表或录用的论文

四、南昌链霉菌中南昌霉素生物合成基因簇的克隆分析及其药物创新潜力(论文参考文献)

  • [1]冰城链霉菌米尔贝霉素高产菌株的工程改造 ——基于次级代谢物生物合成基因簇关系解析[D]. 王海燕. 中国农业科学院, 2020
  • [2]基于大片段克隆技术的罗中链霉菌TRM49605次生代谢产物基因簇挖掘[D]. 李鑫. 塔里木大学, 2020
  • [3]内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征及wblA基因的调控功能[D]. 田文佳. 北京林业大学, 2019(04)
  • [4]罗布泊嗜(耐)盐放线菌的物种多样性、抗生素合成基因以及盐胁迫响应机理初探[D]. 吕玲玲. 华中农业大学, 2018(01)
  • [5]盐霉素产量提高及其活性优化[J]. 谭超,谭华荣,张集慧. 微生物学报, 2016(09)
  • [6]井冈霉素和盐霉素的高产机理与改造[D]. 芦晨阳. 上海交通大学, 2016(01)
  • [7]淀粉酶产色链霉菌1628合成丰加霉素关键基因的研究[D]. 陶立彬. 中国计量学院, 2015(06)
  • [8]冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究[D]. 颜一军. 东北农业大学, 2013(08)
  • [9]聚醚类抗生素盐霉素的生物合成机制[D]. 姜春艳. 上海交通大学, 2013(04)
  • [10]杀粉蝶菌素A1的生物合成研究[D]. 刘倩. 上海交通大学, 2012(10)

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南昌链霉菌南昌霉素生物合成基因簇的克隆与分析及其药物创新潜力
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