一、鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达（论文文献综述）
汪铭锐[1]（2021）在《鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备》文中研究说明鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）引起,以雏鸡再生障碍性贫血以及全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制病。该病分布于全球,是阻碍禽类养殖业发展的重要免疫抑制病之一。CIAV的基因组只有约2.3kb,共编码三个蛋白。VP1作为其唯一的衣壳蛋白,在CIAV诱导宿主产生中和抗体的过程中具有关键性作用。VP2被认为是VP1的一种辅助蛋白或者支架蛋白,帮助VP1蛋白正确折叠,具有双特异性磷酸酶活性,在CIAV的感染中具有重要的作用。VP3则作为一种凋亡素具有诱导细胞凋亡的功能,在医疗领域被广泛研究。本论文就CIAV VP1、VP2蛋白在杆状病毒系统中的表达、CIAV VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备、CIAVVP2蛋白抗原表位的鉴定三个方面进行研究。研究结果对CIAV重组亚单位疫苗的研发、检测方法的建立、CIAV的防控以及VP2蛋白相关功能的深入研究都具有重要意义。1.鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白在杆状病毒中的表达为探究不同表达方式下VP1与VP2蛋白在杆状病毒中表达情况,本研究利用PCR技术扩增出CIAV的VP1、VP2基因,并在VP1与VP2基因之间加入柔性肽序列作为linker,连接到 pFastBacHTA 载体,分别构建 pFastBacHTA-VP1、pFastBacHTA-VP2、pFastBacHTA-VP 1-linker-VP2三种重组供体质粒;将重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒,并分别转染至Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2、rBac-VP1-linker-VP2。IFA 和Western-blot 结果证明,以 rBac-VP1 或 rBac-VP2 单独感染的Sf9中,VP1或VP2蛋白成功表达;以rBac-VP1和rBac-VP2共感染的Sf9细胞中,VP1和VP2蛋白均成功表达;以rBac-VP1-linker-VP2感染的Sf9细胞中,融合蛋白VP1-linker-VP2成功表达。该结果为CIAV亚单位的疫苗研发以及CIAV的防控提供物质基础。2.鸡传染性贫血病毒VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备为制备针对VP2蛋白的单克隆抗体,本研究将CIAV VP2的基因克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2。将重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞,阳性转化菌在0.1mM的IPTG浓度下,37℃诱导4h重组蛋白获得表达;将获得表达的样品超声波破碎后进行SDS-PAGE分析,结果得到大小约50kDa的重组蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,四次免疫后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,以rBac-VP2感染的Sf9细胞以及转染pCAGGS-VP2-Flag的DF1细胞进行IFA筛选,结果成功获得了两株稳定分泌针对CIAV VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名CIAV-VP2-4A12和CIAV-VP2-6B5。Western-blot结果显示两株单抗与不同系统表达的VP2蛋白均反应良好,为研究VP2蛋白的新型抗原表位提供了材料。3.鸡传染性贫血病毒VP2蛋白抗原表位的鉴定以研究内容二中所制备的IFA效价较高的单克隆抗体CIAV-VP2-4A12为研究对象,利用pET-32a作为表达载体将VP2蛋白逐步截短表达,以Western-blot验证不同截短蛋白与单抗CIAV-VP2-4A12的反应情况。结果表明,单克隆抗体CIAV-VP2-4A12识别的最短抗原表位为155KTVRW159。选取GenBank中23株国内外CIAV毒株进行保守性分析,发现该表位在不同毒株间高度保守,为VP2蛋白功能的研究以及CIAV的监测奠定基础。
周建卫[2]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中研究指明猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
刘创[3]（2020）在《鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制》文中指出鹅细小病毒病是由鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）引起的一种急性或亚急性的败血性传染病,主要侵害420日龄的雏鹅,以肠道形成栓塞为主要特征。鹅呼肠孤病毒病（goose reovirus,GRV）又称为“鹅出血性坏死性肝炎”,主要侵害23周龄雏鹅,被感染雏鹅主要的病理变化是肝脾坏死、胰腺出血、肾脏坏死等。这两种病毒通常混合感染,发病急,死亡率较高。本研究对GPV及GRV毒株进行分离鉴定,研制了鹅细小病毒-呼肠孤病毒二联灭活疫苗。主要内容如下:1、GPV和GRV的分离与鉴定本研究对实验室采集的疑似患有GPV病料、GRV病料进行了病原的分离鉴定,并分别命名为GPV毒株（AHDY株）和GRV毒株（JSXZ株）。对以上两种毒株分别进行了序列的测定与分析、动物回归试验等。通过DNAStar软件对AHDY分离株VP3基因、JSXZ分离株σC基因与相应参考株进行序列同源性比对和进化树的构建。结果表明,AHDY分离株与近年来分离GPV参考株同源性在92.1%以上,与MDPV参考株处于不同的分支上,同源性在74.6%80.4%。JSXZ分离株的核苷酸序列与水禽源呼肠孤病毒的有很高的同源性,可达95.9%98.0%,而与鸡源呼肠孤病毒同源性仅42.9%46.6%。JSXZ分离株与水禽源呼肠孤病毒遗传关系较近,而与鸡呼肠孤病毒遗传关系相对较远。动物回归试验表明,2周龄的健康雏鹅感染以上两种毒株后,可分别表现出与自然发病病例一致的临床症状和剖检变化。表明两株分离毒株较好的免疫原性,可用于二联疫苗的研制。2、GPV和GRV二联灭活疫苗的初步研制及免疫效力试验GPV、GRV种毒进行集中大量扩繁并分别进行毒力测定。将以上两种经透析浓缩的抗原液等体积混合后,与吐温-80以96:4的比例混合,按照油水比2:1进行乳化,制备鹅细小病毒-呼肠孤病毒二联灭活疫苗,理化性状检验、安全性及保质期检验结果显示,符合油乳剂灭活疫苗制备标准。为了评价试制二联灭活疫苗的免疫效力,该疫苗接种非免疫种鹅,对其最小免疫剂量、免疫持续期进行了监测。结果表明,在一定范围内,GPV、GRV血清抗体水平均与免疫剂量呈正相关,而且其抗体水平也均随着免疫时间的延长而逐渐升高。以0.8mL/只免疫种鹅时,至免疫后2周,GPV、GRV血清抗体即可上升至阴阳临界值之上,其中1mL免疫剂量组抗体水平更高。免疫持续期试验结果表明,GPV血清抗体水平免疫后3周上升至较高水平,在免疫后4周上升至最高,直至监测至免疫后8周仍为阳性;GRV血清抗体水平在免疫后3周上升至较高水平,在免疫后5周达到峰值,在免疫后7周血清抗体为阳性,而到免疫后第8周就处于阴阳临界值之下。终上所述,以0.8mL/只免疫种鹅,GPV、GRV血清抗体水平至少持续7周。结果表明,本研究研制的二联疫苗免疫种鹅有良好的免疫原性,为进一步开展二联灭活疫苗的研究提供一定的理论依据。
杨育鹏[4]（2020）在《樱桃谷肉鸭脱羽综合征病因的初步研究》文中认为自2017年以来,华东三省（山东、安徽和江苏）陆续出现了一种以樱桃谷鸭为感染对象的,全身羽毛部分或全部脱落,屠宰后羽根难以拔除（毛刺鸭）的临床疾病,暂称为“脱羽综合征”（Feathers Shedding Syndrome,FSS）。该病在2019年临床危害尤为严重,发病鸭以樱桃谷肉鸭为主,发病鸭场该病的发病率为3%-70%。发病鸭主要表现为生长迟缓,采食率下将,羽毛脱落越来越严重;部分鸭群会出现死亡,死亡率不等,给肉鸭养殖户造成巨大损失。因鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）和新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus-related virus,NGPV）感染可能导致相似的临床症状,本研究建立了可同时检测DuCV-1、DuCV-2和NGPV的三重PCR方法,并对山东、安徽和江苏三省采集的脱羽鸭的羽毛囊和各种器官进行了检测,在此基础上对临床病料中的6株DuCV和6株NGPV毒株进行了全基因组扩增和序列分析,并通过动物试验来探讨此病发生的原因,以期为养鸭行业对FSS疾病的科学防控提供了参考依据。本研究分为四个部分:1、检测DuCV-1、DuCV-2和NGPV的三重PCR方法的构建根据DuCV-1、DuCV-2和NGPV的保守序列,应用Oligo7.0软件设计了五条引物,建立了能一步检测DuCV-1、DuCV-2和NGPV的三重PCR方法。该方法特异性好,灵敏度高,对于DuCV-1最低检测浓度为50 copies/μL,DuCV-2的最低检测浓度为50copies/μL,NGPV的最低检测浓度为5×103copies/μL。2、FSS鸭流行情况调查分析2018年8月到2019年6月从山东、安徽和江苏等地的27个表现有FSS症状的樱桃谷鸭养殖场采集了540只（每个场采集20只）发病鸭的羽毛囊和540份各种内脏器官（每种各60份）,运用建立的三重PCR检测方法进行了病毒检测。统计结果表明羽毛囊中DuCV的检出率为78.89%（426/540）,NGPV的检出率为82.78%（447/540）,混合感染为70.00%（378/540）,并发现在4-5周龄的病鸭混合感染更严重。对内脏器官的检测结果表明,所有器官均能检出DuCV和NGPV,其中心脏的DuCV和NGPV的检出率最高,分别为88.33%（53/60）和84.91%（51/60）,脑组织的检测阳性率均最低,21.67%（13/60）和15%（9/60）。对DuCV和NGPV病毒载量检测表明,法氏囊中DuCV的含毒量最高,心脏中NGPV的含毒量最高,羽毛囊中DuCV和NGPV的含毒量都较高,肺脏均为最低。根据我们的临床检测结果可知,FSS病鸭中DuCV和NGPV的含毒量分布几乎一致,二者显示出相同的组织嗜性。3、DuCV和NGPV的全基因组测序和分析根据NCBI上已登录的DuCV和NGPV的全基因组序列分别设计出相应的引物对6株DuCV（DuCV-1和DuCV-2各三株）和6株NGPV进行全基因组扩增,并利用Megline7.0软件进行进化树的构建以及对主要蛋白和基因进行对比分析。结果表明:本研究扩增出的6株DuCV序列与NCBI上已登录的DuCV序列并没有明显差别,DuCV-1的同源性为93.4%-98.5%,DuCV-2的同源性为96.9%-98.7%;6株NGPV位于同一个小的分支中,与NGPV其他毒株的同源性为98.1%-98.8%,与GPV的同源性为91.0%-95.6%。DuCV Rep蛋白没有共同的突变位点,而Cap蛋白中DuCV-1分支只有一个共同突变位点,DuCV-2分支有6个共同的突变位点;NGPV的ITR区域中,有6处核苷酸共同突变,其中包括两处碱基增加;Rep蛋白和Cap蛋白中,分别有7处和10处的核苷酸变异导致了其氨基酸发生变异;同时,对Cap蛋白中的VP3蛋白进行了相应的二级结构和三级结构的预测,并对一些氨基酸变异位点进一步分析。4、动物攻毒试验将166只1日龄大小的健康樱桃谷雏鸭随机分为四组:对照组（16只）、NGPV单独感染组、DuCV单独感染组和NGPV与DuCV共感染组,每组50只。分别在7 DPI、14DPI、21 DPI、28 DPI、35 DPI以及42 DPI,每组分别随机取8只鸭,采集内脏器官和羽毛囊进行病毒载量比较;单独在每个时期采集16只鸭的羽毛囊对病毒的阳性率进行统计记录;同时取3只羽毛囊检测为阳性的鸭分析不同时期羽毛囊中病毒的载量变化。研究发现,混合感染组鸭的临床脱羽症状最为严重;不同时间点各组攻毒鸭羽毛囊中均可以测出攻毒病毒的存在,且随着日龄的增加羽毛囊中病毒的阳性检测率也随之升高;共感染组中DuCV和NGPV的感染率和病毒载量均比单一感染组高,且在21DPI时达到顶峰;对每个检测时间点内脏器官与羽毛囊的病毒载量进行综合分析发现,DuCV和NGPV在攻毒鸭的内脏器官和羽毛囊具有相似的组织嗜性和复制规律。本研究通过临床检测数据和动物攻毒试验数据综合分析,初步推断DuCV和NGPV的共感染可能是FSS产生的根本原因。
史静柯[5]（2020）在《鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制》文中研究说明鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）感染引起的一种危害严重的禽类免疫抑制性疾病,给全球范围内的家禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而目前对CIAV感染及其诱导的免疫抑制的致病分子机理知之甚少,在CIAV基因组编码的三个蛋白VP1、VP2及VP3中,衣壳结构蛋白VP1被认为在介导CIAV感染宿主细胞及诱导产生中和抗体中具有极其重要作用,VP2编码双功能型磷酸酶活性,而VP3则编码凋亡素。CIAV的VP1是如何与易感细胞表面受体结合启动病毒感染及其分子基础尚需进一步探究。本研究在成功分离鉴定到一株CIAV毒株及进行全基因测定分析的基础上,对CIAV的VP1基因进行了克隆表达及稳定表达细胞系构建,且以合成多肽表位为免疫原研制出了 5株抗CIAV的VP1蛋白特异性单克隆抗体。研究结果为进一步开展CIAV分子流行病学调查、创制CIAV诊断技术、鉴定CIAV感染细胞受体及解析VP1介导的CIAV感染分子机制等提供了材料,打下了基础。1.鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ株的分离鉴定及其遗传演化分析为对江苏某地区疑似鸡传染性贫血病例进行病原检测与鉴定,将病料进行了PCR检测以及MDCC-MSB1细胞接种与盲传。PCR结果表明病料以及MDCC-MSB1细胞盲传物中均能扩增出CIAV特异性条带。证明已成功分离到一株CIAV,将其命名为CIAV-JS-CZ。通过设计3对引物对CIAV-JS-CZ分离株进行全基因测序,并借助生物学软件对基因组序列和生物信息学进行分析。结果表明,CIAV-JS-CZ分离株全基因组大小为2298bp;CIAV-JS-CZ分离株与23株国内外的CIAV分离株核苷酸的同源性在96.1%-99%之间,其中与日本分离株（AH9410）同源性高达99%,与我国广东分离株（GD-K-12）同源性最低,为96.1%;CIAV-JS-CZ分离株VP1的第394位氨基酸为谷氨酰胺（Q）,提示该分离株可能具有较强致病性。鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ毒株的分离鉴定丰富了 CIAV毒株数据库,为进一步开展CIAV研究打下了基础。2.鸡传染性贫血病毒VP1基因克隆及其表达细胞系初步构建为探究VP1在CIAV介导感染中作用及鉴定其潜在宿主互作蛋白,本研究以CIAV-JS-CZ的基因组为模板,首先PCR扩增出CIAV的VP1全基因ORF,并经酶切连接后克隆进真核表达载体pcDNA3.1-Hygromycin。重组质粒经测序验证后,命名为pcDNA3.1-Hygromycin-VP1。利用抗CIAV的VP1特异性多克隆抗体进行的间接免疫荧光试验证明,转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1的293T细胞可见特异性亮绿色荧光,而转染对照载体pcDNA3.1-Hygromycin的293T细胞中未见特异性亮绿色荧光。由于课题组观察到LMH细胞可作为CIAV潜在感染靶细胞,将pcDNA3.1-Hygromycin-VP1重组质粒转染LMH,通过药物潮霉素B筛选及有限稀释克隆法,初步获得表达CIAV的VP1的LMH细胞系。CIAV的VP1基因真核表达载体获得及其表达细胞系的初步构建为鉴定VP1介导CIAV感染分子基础及其细胞受体打下了基础。3.抗鸡传染性贫血病毒VP1单克隆抗体的研制为研制抗CIAV的VP1单克隆抗体,本研究在分析VP1的亲水性及抗原性基础上,以设计合成的两段多肽Peptides-1和Peptides-2为免疫原免疫Balb/c小鼠,以合成多肽和转染pcDNA3.1-Hygromycin-VP1真核表达质粒的293T细胞作为筛选原。通过常规方法将小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合、ELISA与IFA筛选鉴定及亚克隆,最终获得5株分泌抗CIAV的VP1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。其中一株是针对表位多肽Peptides-1,命名为CIAV-VP1-1C5;其余4株针对表位多肽 Peptides-2,分别命名为 CIAV-VP1-2E3、CIAV-VP1-2B3、CIAV-VP1-3F4及CIAV-VP1-3C10。5株抗VP1单克隆抗体不仅与包被表位多肽Peptides-1或Peptides-2具有良好的ELISA反应性,而且能通过IFA识别在LMH细胞中表达的VP1蛋白。抗VP1单克隆抗体的研制不仅为进一步构建基于VP1蛋白的CIAV的诊断技术开发提供了试剂,而且为鉴定VP1介导的CIAV感染细胞受体打下了基础。
李汉卿[6]（2020）在《新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性研究》文中研究指明近年来,我国多个养鸭地区出现了以大舌、短喙、生长障碍为主要特征的新发疫病——“短喙侏儒”综合征（Short beak and dwaforsm syndrome,SBDS）,该病主要引起雏鸭上下喙萎缩变短,舌头外伸、肿胀,进而引起采食困难,感染后期胫骨和翅骨易发生骨折,腹泻、麻痹、体重明显低于健康鸭只,导致出栏合格率下降,对我国水禽养殖业造成较大的经济损失。研究人员通过病原分离与鉴定得到一种新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV）,但是将NGPV回归动物却很难复制出与自然感染相似症状的病例。后来流行病学调查发现患有SBDS病的鸭子中,鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）和NGPV混合感染的几率极高。由于禽类的圆环病毒感染所引起的临床症状与SBDS类似,因此DuCV被怀疑也是导致SBDS症状的病原之一。为了明确DuCV和NGPV混合感染能否协同导致SBDS以及二者之间的互相作用,本研究建立了两种病毒共感染的动物模型。本研究将200只健康1日龄樱桃谷肉鸭平均随机分为四组,将来自田间的DuCV YB03毒株和NGPV JS1123毒株通过口服的方式人工感染雏鸭,分为单独感染NGPV组、单独感染DuCV组、混合感染NGPV和DuCV组三个实验组,以及灌服生理盐水作为对照组,在1、3、7、14、21、28、35 DPI（Day post infection）随机选取六只剖杀并监测试验鸭体重、喙长、胫骨长度、临床症状、组织病变、血清学变化、拭子及各脏器的病毒载量等实验指标。研究发现攻毒后在雏鸭的咽喉拭子、肛门拭子以及血清中,NGPV和DuCV在试验验期间都能被检测到。所有攻毒组均出现羽毛凌乱、精神沉郁、发育迟缓、喜卧症状;生长抑制现象以混合感染组最为严重,其次为单独感染NGPV组,最后是单独感染DuCV组。单独感染NGPV组的病鸭还出现流涎、拉稀的症状,混合感染组的病鸭除了有这些症状之外,部分鸭还出现了短喙、舌肿胀、以及麻痹瘫痪的现象。解剖后发现混合感染组的脏器病变要比单独感染的两个组要严重,表现为肝脏质脆并呈现土黄色并伴有出血点、脾脏充血肿大、胸腺肿大并有出血点、肾脏和十二指肠均有出血点,单独感染DuCV组的胸腺有萎缩的症状,免疫器官指数显着性小于对照组（P<0.05）,另外两个攻毒组的免疫器官指数显着性大于对照组（P<0.05）。组织病理学观察发现混合感染组同时表现出NGPV和DuCV单独感染组的病变,表现为免疫器官淋巴细胞凋亡（脾脏还出现脾窦淤血扩张）、肾脏肾小管上皮细胞脱落、肝脏广泛可见肝细胞气球样变性以及少量淋巴细胞浸润和局部胆管周围少量嗜酸性粒细胞浸润、十二指肠上皮脱落。血清生化检测发现,与对照组相比,攻毒组血清中钙、磷的含量均降低,丙氨酸氨基转移酶、总胆红素的含量均升高;此外混合感染组和单独感染NGPV组的病鸭血清中肌酸激酶的含量也出现升高。通过对不同脏器病毒载量检测发现,DuCV和NGPV都有广泛的组织嗜性。总的来看,NGPV在病鸭体内的拷贝数要大于DuCV,并且混合感染组大部分脏器的DuCV病毒载量在前期高于单独感染DuCV组,而在后期低于单独感染DuCV组。本论文对新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性进行了研究,发现NGPV和DuCV协同感染能够导致更严重的SBDS症状产生,为SBDS的深入研究与防治提供了重要理论依据。
刘艳,张靖飞,陈跃飞,胡伟,王峰,王慎涛,田凯歌,王晶钰[7]（2020）在《鹦鹉禽多瘤病毒陕西株VP1基因的克隆及荧光定量PCR检测方法的建立》文中指出为了解鹦鹉禽多瘤病毒（APV）陕西分离株（SX-2018株）VP1基因的分子特征,并建立可用于临床的快速灵敏的APV检测方法,本研究通过PCR扩增了SX-2018株VP1基因序列,并与22株国内外参考株进行了核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果显示:扩增的SX-2018株VP1基因全长为1 032 bp,与其他APV分离株核苷酸相似度为99.1%～100.0%;遗传进化分析显示SX-2018株属于CladeⅡ分支。设计针对VP1基因的特异性引物（209 bp）并构建其相应的质粒标准品,以不同浓度的该质粒标准品为模板扩增并绘制了标准曲线,通过条件优化建立了APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法仅特异性扩增APV,与鹦鹉其它常见病毒无交叉反应,特异性强;对质粒标准品检测的最低浓度达5.4×101拷贝/μL,为常规PCR的100倍;组内组间变异系数分别小于0.5%、1.5%,重复性好。利用该方法与常规PCR方法对疑似APV感染的30份样品进行检测并比较,结果显示:建立的APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法与常规PCR的符合率为86.67%,且阳性检出率高于常规PCR。本研究为我国鹦鹉APV的分子流行病学调查提供了参考数据,为在鹦鹉群中开展该病的筛查提供了有效的技术手段。
王鹏[8]（2019）在《鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP3蛋白单克隆抗体的研制》文中研究说明鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）是引起家禽免疫抑制病的一种重要病原体。该病在世界主要养禽国家都有报道,已在世界范围内广泛分布,给养禽业带来巨大经济损失。本论文就鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及CIAV-CZC1602的全基因测序、鸡传染性贫血病毒VP3蛋白原核表达载体的构建以及抗CIAV-VP3蛋白单克隆抗体的研制三个方面展开研究,对CIAV流行规律、遗传变异以及检测方法建立具有重要意义。1、鸡传染性贫血病毒的分离鉴定以及CIAV-CZC1602株的遗传演化分析本研究对江苏地区养殖场内发生的疑似鸡传染性贫血病毒（CIAV）感染病例以及疑似污染有CIAV的疫苗进行检测与诊断。首先对送检病例及疫苗进行了 CIAV病毒特异性DNA片段的PCR扩增。然后将PCR阳性组织样品及疫苗样品处理后接种CIAV易感细胞MDCC-MSB1细胞进行了病毒分离。成功分离到了四株CIAV病毒,分别命名为CIAV-CZC1602,CIAV-LHC1710,CIAV-HJC1709 和 CIAV-YC1711。同时为了解 CIAV 分离株的全基因变异情况,对CIAV-CZC1602的全基因进行了测序并对其遗传进化进行分析。结果表明,CIAV-CZC1602毒株基因组全长为2298bp,与NCBI上发表的21株CIAV毒株序列比较发现,核苷酸同源性在96.1%99%之间。全基因系统发育进化树分析显示,该毒株与北京株的亲缘关系最近。2、鸡传染性贫血病毒VP3蛋白原核表达载体的构建及其表达验证本研究参考Genbank发表的CIAV cux-1毒株的基因序列（登陆号:M55918）,设计了一对针对CIAV-VP3的特异性引物,用PCR的方法从CIAV基因组中成功扩增出了 VP3基因。同时设计一对针对pGEX-6p-l载体的线性化引物,用PCR的方法将pGEX-6p-l载体线性化。将CIAV-VP3基因片段与pGEX-6p-l载体线性化产物按照一步克隆法进行连接转化后成功的构建了 pGEX-6p-l-VP3重组表达菌,经IPTG诱导表达后,获得大小约35kDa的GST-VP3重组蛋白,重组蛋白具有良好的抗原性。GST-VP3重组蛋白的获得为抗CIAV-VP3单克隆抗体的制备提供了良好的生物材料。3、鸡传染性贫血病毒CIAV-VP3蛋白单克隆抗体的研制本研究以原核表达的GST-VP3重组蛋白作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫,然后采集其脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备针对CIAV-VP3蛋白的单克隆抗体。通过建立间接ELISA和间接免疫荧光（IFA）的双重筛选方法,成功筛选到了 2株针对CIAV-VP3 ’蛋白不同抗原表位的杂交瘤细胞株,分别将其命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8。经过亚类鉴定试剂盒鉴定,两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体类型均为IgG1,Kappa链。Western blot 试验证实,单抗 CIAV-VP3-4D7 和 CIAV-VP3-4G8 均能与 GST-VP3 重组蛋白反应,而与GST蛋白不反应。间接免疫荧光试验证明,单抗CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别在转染了 pcDNA3.1-VP3的DF-1细胞中表达的CIAV-VP3。单抗CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的获得为CIAV-VP3蛋白分子生物学特征研究以及开发基于VP3蛋白的CIAV诊断技术开发奠定了基础。
刘杰[9]（2019）在《鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染增强致病性研究》文中认为鹅细小病毒（GPV）属细小病毒科（parvoviridae）、细小病毒属（parvovirus）,主要引起小鹅瘟,近年来,其在鸭群中可引起鸭大舌短喙综合征。鸭圆环病毒（DuCV）感染可导致宿主免疫抑制,通常与其他病原体共同感染使疾病进展更加复杂。GPV与DuCV共感染在田间广泛存在,但目前对GPV与DuCV共感染对宿主的影响情况不明。为探究GPV和DuCV是否协同增强了致病性,本研究通过临床病例分离鉴定了GPV与DuCV;通过建立GPV与DuCV共感染的动物模型,以病毒学、病理学、分子生物学等方法进行了GPV与DuCV协同复制与协同致病研究。病毒分离鉴定结果显示,分离得到的GPV与DuCV均为当前田间流行株,并制备了GPV多克隆抗体和DuCV多克隆抗体用于实验检测。将GPV与DuCV腹腔接种于2日龄樱桃谷肉鸭,在感染后第10天、第20天和第30天进行剖杀。GPV与DuCV共感染鸭表现精神沉郁,生长发育迟缓,羽毛凌乱,体重增长显着缓慢。血涂片观察可见共感染组鸭血液中异嗜性粒细胞和淋巴细胞明显增多。对血清中各种酶活力指标进行检测,结果发现,感染前期共感染组谷丙转氨酶（ALT）水平显着高于单感染组和正常组,反映共感染GPV和DuCV对肝脏的损伤加重。共感染组的大体病变明显比单感染组严重,表现为肝脏出血坏死,脾脏萎缩苍白,胸腺、法氏囊严重萎缩,骨髓苍白。组织病理学变化表现为:免疫系统中,脾脏红髓和白髓边界消失,淋巴细胞稀疏,出血,异嗜性粒细胞浸润;胸腺淋巴细胞稀疏,胸腺小叶间大量异嗜性粒细胞浸润,胸腺小体崩解;法氏囊髓质淋巴细胞稀疏;骨髓造血细胞大量流失。消化系统中,十二指肠绒毛上皮坏死脱落;肝脏严重空泡变性并有炎性细胞浸润。泌尿系统中,肾脏出血,肾小管上皮细胞空泡变性、坏死脱落。通过qPCR对各个时间点不同组织内病毒载量进行检测,我们发现,感染初期共感染组的病毒载量显着低于单感染组,但随着病程的发展,单感染组的病毒载量下降,GPV和DuCV共感染动物体内两种病毒的载量明显升高,均显着高于单感染组。通过IHC检测GPV和DuCV在体内的分布,在肝脏、脾脏、肾脏、十二指肠、法氏囊内检测到阳性细胞。随着日龄的增加,共感染组阳性细胞数量及信号强度明显高于单感染组,但两种病毒分布定位基本一致。感染初期,两种病毒均定位在肝细胞核,接毒后第30天,肝细胞的胞浆和胞核均能检测到阳性信号。肾脏的髓袢处的肾小管可检测到阳性细胞。感染前期,十二指肠中的阳性细胞主要在肠隐窝处,后期存在于十二指肠肠绒毛的杯状细胞中。法氏囊中DuCV阳性细胞主要分布在髓质,GPV阳性细胞在皮质和髓质均可检测到。综上所述,GPV与DuCV可协同促进各自的复制、协同增强致病性。本研究从致病性和病毒复制两方面揭示了共感染的GPV与DuCV具有协同致病作用。本研究不仅对后续研究GPV与DuCV共感染机制明确了方向,更将为免疫抑制病或其它禽病共感染研究提供了科学依据。
贾梅玉[10]（2019）在《圆圈病毒3型亚单位疫苗和DNA疫苗的制备以及免疫保护性研究》文中提出近年来传染性病毒性腺胃炎给养禽业带来了巨大的危害,在管理不善的养殖场,发病率大约在15%60%,其可发生于不同品种的蛋鸡和肉鸡,并且流行范围较广。尽管病毒性腺胃炎危害严重,但其致病病原一直未有定论,据研究与呼肠孤病毒、网状内皮组织增生症病毒、腺病毒等病毒相关。在这种情况下,无法采用有效方法来防控传染性病毒性腺胃炎的发生。2017年,李根在患有鸡传染性病毒性腺胃炎的病鸡的腺胃中首次鉴定了圆圈病毒3型（Gyrovirus 3,GyV3）。通过回顾性流行病学调查及回归动物实验发现GyV3可以引起鸡的免疫抑制及腺胃肿大,然而至今还没有关于GyV3疫苗的研究,因此制备GyV3亚单位疫苗以及DNA疫苗进行免疫原性研究,从而对动物进行保护。GyV3属于单链环状DNA病毒,由三个开放阅读框构成,分别为衣壳蛋白VP1（1392bp）,骨架蛋白VP2（720bp）和凋亡蛋白VP3（378bp）。为获得免疫原性强及效果好的疫苗,制备了亚单位疫苗和DNA疫苗。选取了VP1的第90位至463位氨基酸进行表达用于制备亚单位疫苗;将VP1第90位至463位氨基酸与VP2通过柔性氨基酸linker（GSGGS）进行串联进行表达以制备亚单位疫苗。经SDS-PAGE及Western blot试验验证原核表达的目的蛋白表达成功。构建p EGFP-VP1真核表达质粒用于鸡群DNA疫苗的接种。将p EGFP-VP1表达质粒转染DF1细胞,目的蛋白可以在DF1细胞中成功表达。为了验证制备的亚单位疫苗和DNA疫苗的免疫原性,进行了动物免疫原性检测试验;为进一步验证亚单位疫苗和DNA疫苗具有动物保护效果,进行了动物保护试验。接种亚单位疫苗和DNA疫苗鸡的体重与正常组鸡体重无明显差异,说明疫苗接种后并不影响鸡的生产性能。检测35日龄鸡的抗体效价,VP190-463亚单位疫苗组达到1:25600,VP190-463-linker-VP2亚单位疫苗组达到1:12800;EGFP-VP1 DNA疫苗组达到1:160。在动物保护性试验中,攻毒后一周检测鸡群中GyV3病毒的感染率,两种亚单位疫苗的动物保护率都可高达100%;DNA疫苗组为70%。经试验动物临床症状、抗体效价、鸡群生长状况、PCR检测阳性率及病理组织学变化等结果显示:亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护性要明显优于DNA疫苗。虽然两种亚单位疫苗都具有良好的免疫原性及100%的免疫保护作用,但VP190-463亚单位疫苗诱导机体产生的抗体滴度要高于VP190-463-VP2亚单位疫苗,因此VP190-463亚单位疫苗优于VP190-463-VP2亚单位疫苗。本研究首次进行GyV3亚单位疫苗和DNA疫苗的相关研究,为临床预防GyV3的感染及传染性病毒性腺胃炎的发生提供了方法和技术支撑。
二、鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达（论文提纲范文）
（1）鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 CIAV病原学特征 |
| 1.1 CIAV的发现 |
| 1.2 CIAV的分类 |
| 1.3 CIAV的特性以及培养方式 |
| 1.4 CIAV的基因组结构 |
| 1.5 CIAV的蛋白结构和功能 |
| 2 CIAV的流行病学特征 |
| 3 CIAV的临床症状以及病理变化 |
| 4 CIAV的致病机理 |
| 5 CIAV的诊断方法 |
| 5.1 病原分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学方法 |
| 6 CIAV的防治 |
| 7 疫苗研发 |
| 7.1 亚单位疫苗 |
| 7.2 DNA疫苗 |
| 7.3 弱毒疫苗以及灭活苗 |
| 8 CIAV单克隆抗体的研究 |
| 9 研究目的及意义 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白在杆状病毒中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 重组供体质粒的构建 |
| 2.3 重组杆粒的构建及鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的获得与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 CIAV VP1、VP2基因的扩增结果 |
| 3.2 重组供体质粒构建正确 |
| 3.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病毒VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.2 重组质粒pET-32a-VP2的构建 |
| 2.3 表达菌株的构建以及蛋白表达 |
| 2.4 小鼠免疫 |
| 2.5 筛选方法的构建 |
| 2.6 细胞融合 |
| 2.7 阳性杂交瘤筛选 |
| 2.8 细胞的亚克隆 |
| 2.9 单克隆抗体Western-blot鉴定 |
| 2.10 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.12 腹水的制备以及效价测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 CIAV VP2基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒pET-32a-VP2的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白His-VP2的表达 |
| 3.4 筛选方法的建立 |
| 3.5 免疫小鼠血清的IFA鉴定 |
| 3.6 杂交瘤上清的IFA鉴定 |
| 3.7 单克隆抗体的Western-blot鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.9 单克隆抗体的特异性分析 |
| 3.10 腹水效价测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡传染性贫血病毒VP2蛋白抗原表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 截短表达引物设计 |
| 2.2 截短表达菌株的构建 |
| 2.3 截短蛋白的表达 |
| 2.4 抗原表位的定位 |
| 2.5 保守性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 各个截短菌株菌液PCR结果 |
| 3.2 抗原表位的定位 |
| 3.3 保守性分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录: 试剂配制 |
| 致谢 |
（2）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（3）鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鹅细小病毒概述 |
| 1.1.1 形态学和理化特性 |
| 1.1.2 分子生物学特征 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 症状及病理变化 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 疫苗的研究进展 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒概述 |
| 1.2.1 形态学和理化特征 |
| 1.2.2 分子生物学特征 |
| 1.2.3 流行病学和致病性 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.2.5 疫苗的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株、载体和细胞 |
| 2.1.2 试验用胚及动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 试验主要溶液及培养基的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.2 二联灭活疫苗的研制 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离情况 |
| 3.1.2 PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 序列测定与分析 |
| 3.1.4 动物回归试验结果 |
| 3.2 二联灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 种毒的纯净性检测 |
| 3.2.2 病毒毒力的测定结果 |
| 3.2.3 抗原最佳灭活条件的确定 |
| 3.2.4 灭活疫苗物理性状检验 |
| 3.2.5 安全性检验 |
| 3.2.6 最小免疫剂量测定结果 |
| 3.2.7 免疫持续期试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GPV和 GRV的分离与鉴定 |
| 4.2 二联灭活疫苗的初步研制 |
| 4.3 疫苗的免疫效力试验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）樱桃谷肉鸭脱羽综合征病因的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭羽毛囊脱落综合征概述 |
| 1.2 鸭圆环病毒 |
| 1.2.1 DuCV的发现 |
| 1.2.2 DuCV分类 |
| 1.2.3 DuCV生物学特征 |
| 1.2.4 DuCV的流行性和致病性研究 |
| 1.2.5 DuCV的诊断和培养 |
| 1.2.6 DuCV防控与治疗 |
| 1.3 新型鸭细小病毒 |
| 1.3.1 水禽细小病毒分类简介 |
| 1.3.2 鸭短喙-侏儒综合征概述 |
| 1.3.3 NGPV的研究 |
| 1.4 DuCV与NGPV共感染的研究情况 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 酶和相关试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 溶液配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 检测DuCV-1、DuCV-2和NGPV三重PCR方法的建立 |
| 2.2.2 临床脏器和羽毛囊样品检测 |
| 2.2.3 DuCV和NGPV病毒的遗传进化分析 |
| 2.2.4 动物试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床解剖症状 |
| 3.1.1 临床主要症状 |
| 3.1.2 解剖主要症状 |
| 3.2 三重PCR方法的建立及验证 |
| 3.2.1 三重PCR方法的最佳反应条件 |
| 3.2.2 三重PCR方法的特异性检测 |
| 3.2.3 三重PCR方法的灵敏性检测 |
| 3.2.4 三重PCR方法的实际验证 |
| 3.3 临床脏器和羽毛囊样品检测结果及分析 |
| 3.3.1 不同鸭场羽毛囊中NGPV与DuCV感染的统计 |
| 3.3.2 临床组织器官中NGPV与DuCV感染的统计 |
| 3.3.3 羽毛囊和临床组织器官中病毒载量的测定和比较 |
| 3.3.4 不同日龄病鸭中羽毛囊阳性率和病毒载量的比较 |
| 3.4 DuCV和NGPV病毒的遗传进化分析 |
| 3.4.1 DuCV和NGPV全基因组的扩增 |
| 3.4.2 DuCV和NGPV全基因组分析 |
| 3.5 动物攻毒试验结果 |
| 3.5.1 攻毒试验动物主要症状 |
| 3.5.2 不同时期羽毛囊检测阳性率和病毒载量统计分析 |
| 3.5.3 不同时期各内脏器官和羽毛囊病毒载量统计分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DuCV-1、DuCV-2和NGPV三重PCR方法的建立和运用 |
| 4.2 FSS疾病的病因初探及动物回归试验验证 |
| 4.3 DuCV和NGPV基因组分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文情况 |
（5）鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 CIAV的病原学研究 |
| 1.1 CIAV的发现和命名 |
| 1.2 CIAV的病毒学分类 |
| 1.3 CIAV的基因组结构 |
| 1.4 CIAV的复制方式和培养特性 |
| 2 CIAV编码的蛋白及功能 |
| 2.1 ORF3编码的VP1 |
| 2.2 ORF1编码的VP2 |
| 2.3 ORF2编码的VP3 |
| 3 CIAV的流行病学 |
| 4 CIAV的致病机理 |
| 5 CIAV的临床表现 |
| 5.1 CIAV的临床症状 |
| 5.2 CIAV的病理变化 |
| 6 CIAV的混合感染 |
| 7 CIAV的诊断方法 |
| 7.1 血清学诊断 |
| 7.2 分子生物学检测方法 |
| 8 CIAV的防治 |
| 8.1 加强饲养管理 |
| 8.2 免疫接种 |
| 9 研究目的和意义 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病毒CIAV-JS-CZ株的分离鉴定及其遗传演化分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2 病毒的全基因测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料PCR检测结果 |
| 3.2 MDCC-MSB1细胞上分离病毒结果 |
| 3.3 全基因扩增结果 |
| 3.4 酶切鉴定结果 |
| 3.5 同源性比较和遗传进化分析 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病毒VP1基因克隆及其表达细胞系的初步构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CIAV-VP1真核表达载体构建和表达 |
| 2.2 表达CIAV-VP1细胞系的初步构建 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CIAV真核表达载体构建结果 |
| 3.2 表达CIAV-VP1细胞系初步构建结果 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 抗鸡传染性贫血病毒VP1单克隆抗体的研制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 CIAV-VP1单克隆抗体筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆及建株 |
| 2.7 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 2.8 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.9 腹水的制备与纯化 |
| 2.10 腹水效价测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 免疫原的选择 |
| 3.2 CIAV-VP1单克隆抗体筛选方法建立的结果 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体的特异性鉴定结果 |
| 3.6 腹水效价测定结果 |
| 3.7 单克隆抗体纯化效果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鹅细小病毒概述 |
| 1.1.1 GPV基因组特征 |
| 1.1.2 GPV编码蛋白功能 |
| 1.1.3 GPV形态特征及理化特性 |
| 1.1.4 GPV培养特性 |
| 1.1.5 GPV流行病学 |
| 1.1.6 GPV诊断方法 |
| 1.1.7 GPV免疫学研究 |
| 1.2 鸭圆环病毒概述 |
| 1.2.1 DuCV基因组特征 |
| 1.2.2 DuCV编码蛋白功能 |
| 1.2.3 DuCV形态特征及理化特性 |
| 1.2.4 DuCV培养特性 |
| 1.2.5 DuCV流行病学 |
| 1.2.6 DuCV致病机制 |
| 1.2.7 DuCV诊断方法 |
| 1.3 不同病毒共感染研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验毒株 |
| 2.1.2 试验鸭胚及试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 相关试剂配制 |
| 2.1.5 实验设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 DuCV毒株的分离 |
| 2.2.2 NGPV毒株的分离与增殖 |
| 2.2.2.1 NGPV病料处理 |
| 2.2.2.2 NGPV传代增殖 |
| 2.2.3 病毒DNA提取 |
| 2.2.4 毒株病毒载量检测 |
| 2.2.4.1 NGPV毒株病毒载量检测 |
| 2.2.4.2 DuCV毒株病毒载量检测 |
| 2.2.5 NGPV、DuCV单独及混合感染动物模型的建立 |
| 2.2.5.1 临床症状监测 |
| 2.2.5.2 体重以及生长情况监测 |
| 2.2.5.3 拭子采集 |
| 2.2.5.4 血液生理生化指标检测 |
| 2.2.5.5 剖检病变观察及免疫器官指数检测 |
| 2.2.5.6 病理组织学观察 |
| 2.2.5.7 核酸DNA提取 |
| 2.2.5.8 组织病毒载量检测 |
| 2.2.5.9 实验数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DuCV毒株病毒鉴定 |
| 3.2 NGPV毒株病毒鉴定 |
| 3.3 试验动物单独及混合接种NGPV、DuCV模型的建立 |
| 3.3.1 临床症状监测 |
| 3.3.2 相关临床指标 |
| 3.3.3 免疫器官指数 |
| 3.3.4 大体剖检病变 |
| 3.3.5 组织病理学变化 |
| 3.3.6 血清临床指标检测 |
| 3.3.7 病毒血症及拭子检测 |
| 3.3.7.1 NGPV检测 |
| 3.3.7.2 DuCV检测 |
| 3.3.8 组织病毒载量检测 |
| 3.3.8.1 组织NGPV检测 |
| 3.3.8.2 组织DuCV检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NGPV和 DuCV共感染雏鸭会导致产生比二者单独感染更严重的临床症状 |
| 4.2 NGPV和 DuCV在雏鸭体内共感染时会造成更严重的免疫抑制和组织损伤 |
| 4.3 NGPV和 DuCV在雏鸭体内共感染在前期能够相互促进病毒在体内的复制 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（7）鹦鹉禽多瘤病毒陕西株VP1基因的克隆及荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株和临床样品 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 APV VP1基因克隆与序列分析 |
| 1.3.1 VP1基因克隆 |
| 1.3.2 VP1基因序列分析 |
| 1.4 重组质粒标准品的构建与鉴定 |
| 1.5 荧光定量PCR程序优化 |
| 1.6 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 1.7 特异性试验 |
| 1.8 敏感性试验 |
| 1.9 重复性试验 |
| 1.1 0 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 APV VP1基因克隆与分析 |
| 2.2 重组质粒标准品的构建结果 |
| 2.3 荧光定量PCR程序优化 |
| 2.4 标准曲线的建立 |
| 2.5 特异性试验结果 |
| 2.6 敏感性试验结果 |
| 2.7重复性试验结果 |
| 2.8 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
（8）鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP3蛋白单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鸡传染性贫血病毒病原学特征 |
| 1.1 鸡传染性贫血病毒发现 |
| 1.2 鸡传染性贫血病毒的分类地位 |
| 1.3 鸡传染性贫血病毒的形态结构和理化性质 |
| 1.4 鸡传染性贫血病毒的培养特性 |
| 2 鸡传染性贫血病毒的基因组结构、蛋白及功能 |
| 2.1 鸡传染性贫血病毒的基因组结构特征 |
| 2.2 鸡传染性贫血病毒的蛋白及其作用 |
| 3 鸡传染性贫血的流行病学 |
| 4 鸡传染性贫血的临床症状及病理变化 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 病理变化 |
| 5 鸡传染性贫血病毒的致病机理 |
| 5.1 鸡传染性贫血病毒的免疫抑制作用 |
| 5.2 鸡传染性贫血病毒与其它病毒共感染 |
| 6 鸡传染性贫血病毒的诊断技术 |
| 7 鸡传染性贫血的预防和防治 |
| 8 研究目的和意义 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病毒的分离鉴定以及CIAV-CZC1602株的遗传演化分析 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 病毒的全基因测序 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PCR检测结果 |
| 3.2 细胞病毒分离结果 |
| 3.3 细胞病变结果 |
| 3.4 全基因扩增结果 |
| 3.5 酶切鉴定结果 |
| 3.6 同源性比较和遗传进化分析 |
| 3.7 生物信息学分析 |
| 4. 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病毒VP3蛋白原核表达载体的构建及其表达验证 |
| 1. 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 CIAV-VP3基因的引物设计与PCR扩增 |
| 2.2 pGEX-6p-1载体的线性化 |
| 2.3 pGEX-6p-1- VP3重组载体构建 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 CIAV-VP3基因的扩增结果 |
| 3.2 pGEX-6p-1线性化扩增结果 |
| 3.3 pGEX-6p-1-VP3重组载体的PCR鉴定 |
| 3.4 pGEX-6p-1-VP3重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.5 pGEX-6p-1-VP3重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 3.6 pGEX-6p-1-VP3重组蛋白纯化鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 研究内容三 鸡传染性贫血病毒VP3蛋白单克隆抗体的研制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 VP3多肽的合成 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 杂交瘤融合 |
| 2.4 阳性克隆的筛选 |
| 2.5 阳性细胞的亚克隆 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 2.7 腹水的制备及抗体的纯化 |
| 2.8 单克隆抗体的生物学特性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 VP3多肽的选取 |
| 3.2 多肽ELISA筛选方法的初步建立 |
| 3.3 荧光筛选方法的建立 |
| 3.4 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.5 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.6 Western-blot鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体纯化效果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染增强致病性研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鹅细小病毒研究概述 |
| 1.1.1 病毒特征 |
| 1.1.2 流行病学研究 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 病理变化 |
| 1.2 鸭圆环病毒的研究概述 |
| 1.2.1 病原体的特征 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 病理变化 |
| 1.3 病毒共感染研究进展 |
| 1.4 GPV与DuCV共感染研究现状 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 鸭胚、细胞和实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验设备、器材 |
| 2.1.5 试验地点 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DuCV分离与增殖 |
| 2.2.2 GPV分离与增殖 |
| 2.2.3 GPV多克隆抗体及DuCV多克隆抗体的制备 |
| 2.2.4 GPV、DuCV共感染模型的建立 |
| 2.2.5 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离与增殖 |
| 3.1.1 DuCV分离鉴定 |
| 3.1.2 DuCV半数感染量（ID50）检测 |
| 3.1.3 GPV PCR鉴定 |
| 3.1.4 GPV ELISA鉴定 |
| 3.1.5 GPV回归动物实验 |
| 3.1.6 GPV半数细胞感染量（TCID50）检测 |
| 3.2 GPV多克隆抗体制备 |
| 3.2.1 GPV vp3基因的获取 |
| 3.2.2 GPV VP3重组质粒鉴定 |
| 3.2.3 GPV VP3蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 GPV VP3蛋白的纯化 |
| 3.2.5 GPV VP3蛋白浓度测定 |
| 3.2.6 GPV VP3蛋白Western Blot检测 |
| 3.2.7 GPV多克隆抗体效价 |
| 3.2.8 GPV多克隆抗体验证 |
| 3.3 DuCV多克隆抗体制备结果 |
| 3.3.1 DuCV cap基因的获取 |
| 3.3.2 DuCV CAP重组质粒鉴定 |
| 3.3.3 DuCV CAP蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 DuCV CAP蛋白的纯化 |
| 3.3.5 DuCV CAP蛋白浓度测定 |
| 3.3.6 DuCV CAP蛋白Western Blot检测 |
| 3.3.7 DuCV多克隆抗体效价 |
| 3.3.8 DuCV多克隆抗体验证 |
| 3.4 实验动物接种GPV、DuCV共感染的人工致病实验 |
| 3.4.1 临床症状 |
| 3.4.2 大体病变 |
| 3.4.3 血液学检测 |
| 3.4.4 病理组织学病变 |
| 3.4.5 病毒载量检测 |
| 3.4.6 病原分布检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GPV、DuCV协同增强致病性 |
| 4.2 GPV、DuCV共感染促进双方病毒复制 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）圆圈病毒3型亚单位疫苗和DNA疫苗的制备以及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡传染性病毒性腺胃炎流行病学及病原学概述 |
| 1.1.1 鸡传染性病毒性腺胃炎流行病学概述 |
| 1.1.2 鸡传染性病毒性腺胃炎病原学概述 |
| 1.2 GyV3研究进展 |
| 1.2.1 GyV3的发现 |
| 1.2.2 GyV3病原学研究 |
| 1.3 动物基因工程疫苗研究进展 |
| 1.3.1 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3.2 基因工程DNA疫苗 |
| 1.3.3 动物单链环状DNA病毒疫苗研究现状 |
| 1.3.3.1 鸡传染性贫血病毒疫苗研究进展 |
| 1.3.3.2 鸭圆环病毒疫苗研究进展 |
| 1.3.3.3 猪圆环Ⅱ型疫苗研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 病毒及试验动物 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.1.5 试验仪器 |
| 2.1.6 试验地点 |
| 2.2 GyV3亚单位疫苗和DNA疫苗的制备 |
| 2.2.1 GyV3两种亚单位疫苗的制备 |
| 2.2.1.1 样品DNA的提取 |
| 2.2.1.2 VP1_(90-463)基因的克隆 |
| 2.2.1.3 VP1_(90-463)-linker-VP2 基因的克隆 |
| 2.2.1.4 PCR产物回收 |
| 2.2.1.5 BL21感受态细胞的制备 |
| 2.2.1.6 重组质粒的构建 |
| 2.2.1.7 蛋白的表达,纯化与复性 |
| 2.2.1.8 SDS-PAGE法检测纯化后的目的蛋白 |
| 2.2.1.9 蛋白的Western blot验证 |
| 2.2.1.10 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.2 GyV3 DNA疫苗的制备 |
| 2.2.2.1 样品DNA的提取 |
| 2.2.2.2 VP1基因的克隆 |
| 2.2.2.3 PCR产物回收 |
| 2.2.2.4 重组质粒的构建 |
| 2.2.2.5 重组质粒的真核表达鉴定 |
| 2.2.2.6 进行细胞表达蛋白的Western blot验证 |
| 2.3 GyV3亚单位疫苗和DNA疫苗免疫原性试验 |
| 2.3.1 GyV3亚单位疫苗动物免疫接种试验 |
| 2.3.1.1 GyV3亚单位疫苗抗体消长规律监测 |
| 2.3.1.2 动物生长情况监测 |
| 2.3.2 GyV3DNA疫苗动物免疫接种试验 |
| 2.3.2.1 GyV3DNA疫苗抗体消长规律监测 |
| 2.3.2.2 动物生长情况监测 |
| 2.3.2.3 血清中IFN-γ含量检测结果 |
| 2.4 GyV3亚单位疫苗和DNA疫苗动物保护性试验 |
| 2.4.1 GyV3亚单位疫苗动物保护性试验 |
| 2.4.1.1 动物GyV3病毒感染率检测 |
| 2.4.1.2 大体及病理组织学病变观察 |
| 2.4.2 GyV3DNA疫苗动物保护性试验 |
| 2.4.2.1 动物GyV3病毒感染率检测 |
| 2.4.2.2 大体及病理组织学病变观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 GyV3两种亚单位疫苗免疫效果检测 |
| 3.1.1 GyV3原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.1.2 VP1_(90-463)和VP1_(90-463)-VP2表达纯化及Western blot验证 |
| 3.1.3 两种亚单位疫苗免疫原性检测结果 |
| 3.1.3.1 抗体消长规律监测结果 |
| 3.1.3.2 鸡群体重监测 |
| 3.1.4 两种亚单位疫苗动物保护试验 |
| 3.1.4.1 动物保护率 |
| 3.1.4.2 动物组织器官大体剖检病变 |
| 3.1.4.3 动物组织器官病理组织学病变 |
| 3.2 GyV3两种DNA疫苗免疫效果检测 |
| 3.2.1 GyV3真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 GyV3真核表达载体在DF1 细胞上的表达鉴定 |
| 3.2.3 DNA疫苗免疫原性检测 |
| 3.2.3.1 抗体消长规律监测 |
| 3.2.3.2 鸡群生长情况监测 |
| 3.2.3.3 血清中IFN-γ含量检测 |
| 3.2.4 DNA疫苗动物保护性试验 |
| 3.2.4.1 动物保护率 |
| 3.2.4.2 动物组织器官大体剖检病变 |
| 3.2.4.3 动物组织器官病理组织学病变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达（论文参考文献）
- [1]鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备[D]. 汪铭锐. 扬州大学, 2021
- [2]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [3]鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制[D]. 刘创. 山东农业大学, 2020(10)
- [4]樱桃谷肉鸭脱羽综合征病因的初步研究[D]. 杨育鹏. 山东农业大学, 2020
- [5]鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP1基因克隆表达与单克隆抗体研制[D]. 史静柯. 扬州大学, 2020
- [6]新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性研究[D]. 李汉卿. 山东农业大学, 2020
- [7]鹦鹉禽多瘤病毒陕西株VP1基因的克隆及荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 刘艳,张靖飞,陈跃飞,胡伟,王峰,王慎涛,田凯歌,王晶钰. 中国预防兽医学报, 2020(04)
- [8]鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其VP3蛋白单克隆抗体的研制[D]. 王鹏. 扬州大学, 2019
- [9]鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染增强致病性研究[D]. 刘杰. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]圆圈病毒3型亚单位疫苗和DNA疫苗的制备以及免疫保护性研究[D]. 贾梅玉. 山东农业大学, 2019(01)