一、Determining Cotton Fiber Gene Function via Structuring of Mutant Populations for High-Throughput Reverse Genetics（论文文献综述）
王昊一[1]（2021）在《油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘》文中提出甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是中国最重要的油料作物之一。国产油菜的主要问题之一是其种子含油量偏低。因此,提高种子含油量是国产油菜育种的重要目标之一。以往针对提高油菜种子含油量的研究大都着眼于增加油脂的合成,但是,有关通过抑制引起种子油脂消减基因的表达进而提高种子含油量的研究相对较少,而这同样不失为提高种子含油量的有效策略。GDSL脂酶参与种子油脂消减过程,前人研究发现,拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在5个GDSL类种子脂肪酸消减基因（Seed fatty acid reducers,SFARs）,过表达每个SFAR基因都能够显着降低拟南芥种子含油量,相反,敲除每个SFAR基因则能显着提高拟南芥种子含油量。因此,我们推测在油菜中敲除SFARs的同源基因极有可能提高油菜种子含油量。然而,甘蓝型油菜是复杂的异源四倍体植物,油菜BnSFAR家族的组成比拟南芥复杂得多,不同亚基因组的SFAR可能具有不同的表达模式与功能。此外,油菜种子含油量是受到多基因调控的复杂数量性状。以往大多数与含油量相关的QTLs的鉴定是基于两个亲本后代遗传群体含油量性状的变异,即,QTLs的发现局限于双亲之间相关基因的等位变化的有无。近年来,我们对大规模油菜种质资源群体进行了基因组重测序,为在具有丰富多态性的遗传群体中进一步发掘含油量相关QTL及基因打下基础。围绕上述问题,我们开展了以下工作:（1）利用定向诱导基因组局部突变（Targeting induced local lesions in genomes,TILLING）和CRISPR/Cas9技术创制了bnsfars突变体,并验证BnSFARs对油菜种子含油量的影响;（2）通过对290份油菜核心种质资源的种子含油量进行全基因组关联分析（Genome-wide association study,GWAS）,进一步发掘了调控油菜种子含油量的相关基因。主要结果如下:（1）鉴定到了甘蓝型油菜基因组上的222个BnGDSLs,平均分布于A和C亚基因组上,分别有6和4个亚家族,且这些BnGDSLs与拟南芥GDSL脂酶基因（AtGDSLs）存在着明显的共线性关系。通过序列比对,与AtSFARs（AtSFAR1至AtSFAR5）高度同源的12个BnGDSLs被挑选为候选的BnSFARs。不同BnSFAR亚家族之间的相对表达水平差异巨大,但同一BnSFAR亚家族内的同源拷贝之间的表达模式则大体相似。对870份油菜种质资源群体中分布在BnSFARs编码区域的SNPs与种子含油量进行相关性分析表明,BnSFAR1与BnSFAR4基因上的SNPs与种子含油量显着相关（P<0.05）,BnSFAR1、BnSFAR4和BnSFAR5基因上的SNPs与种子油酸含量显着相关（P<0.05）。（2）采用基于甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate,EMS）诱变的TILLING技术,筛选到bnsfar1和bnsfar4的纯合单突变体、纯合双突变体。在相同遗传背景下,bnsfar4的纯合单突变体（包括bnsfar4.C03a、bnsfar4.A06a、bnsfar4.A06b、bnsfar4.Cnnb）的种子含油量与相应位点没有突变的EMS处理植株没有明显区别,但其双突变体（包括bnsfar4.A06a bnsfar4.C03a和bnsfar4.A06b bnsfar4.Cnnb）的种子含油量比相应位点没有突变的EMS处理植株显着提高了8.7%-12.1%。与bnsfar4不同,bnsfar1的纯合双突变体（bnsfar1.Ann bnsfar1.C04）种子含油量与相应位点没有突变的EMS处理植株相比没有明显区别。由于EMS会导致全基因组范围的大量随机突变,因此TILLING创制的突变体种子含油量基本上都显着低于未经EMS诱变处理的对照植株。（3）利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了BnSFAR4的四个同源拷贝和BnSFAR5的两个同源拷贝,创制了bnsfar4四突变体（bnsfar4.A06a bnsfar4.C03a bnsfar4.A06b bnsfar4.Cnnb）和bnsfar5双突变体（bnsfar5.A03 bnsfar5.C07）。bnsfar4突变体的T3代种子和T4代种子的含油量分别比野生型种子提高9.7%-14.5%和12.9%,而bnsfar5突变体植株的T3代种子和T4代种子的含油量分别比野生型提高了10.4%和11.2%。除了bnsfar4突变体的T4代种子外,其它突变体种子的千粒重与野生型相比都没有明显变化,且突变体种子萌发率以及萌发初期的根长和芽长与野生型相比也没有明显变化。此外,bnsfar4突变体种子细胞内的油体尺寸显着大于野生型,且突变体种子含油量在种子发育后期和萌发初期的下降速率明显慢于野生型。（4）测定了290份油菜核心种质材料在两个试验点的种子含油量,并进行了GWAS分析,鉴定到C07染色体上35.25-35.79 Mb区域内的SNPs与种子含油量存在显着的关联性(-logp10>5)。其中SNP位点Chr C07＿35249208与Bna C07g30920D（Bna.PTL.C07）紧密连锁（决定系数R2=0.68）。Bna.PTL.C07是Patatin-like lipase（PTL）脂酶基因家族的一员,分布于其5’端调控区的6个SNPs与种子含油量显着相关（P<0.05）,其中2个SNP位点位于CAAT-box中。总之,本研究分析了油菜BnGDSL基因家族并创制了BnSFARs的功能受到有效阻控的高含油量育种基础材料;展示了CRISPR/Cas9相较TILLING在异源多倍体作物突变体创制上的优势;发掘了可能与油菜种子含油量相关的基因位点。这项研究在采用精准设计育种的手段提高油菜种子含油量方面作了有益尝试。
鹿田[2]（2021）在《靶向调控相关转录蛋白的先导化合物的发现及作用机制研究》文中研究说明转录调控是各个蛋白、细胞、组织等在发挥其功能时对基因的翻译表达的特定的调节形式,是生物大分子在发挥生命活动时的的必要环节。一方面,它可以通过完全停止转录来对特定基因的表达进行限制;另一方面,它也可以通过激活转录,进而激活某些只在特定环境条件下表达的基因。而且,这些转录调控还可以通过不同的翻译后修饰来发生。转录调控对于生物的各项生命活动功能发挥起到了至关重要的作用,其涉及到许多不同通路和转录因子。转录调控涉及到的生物学过程非常广泛,从可变剪切到DNA修复,蛋白的表达,细胞组织的分化与再生到组织癌症的产生和耐药都能和转录调控关系密切。Hippo信号通路最早在果蝇的基因中被发现,其在哺乳动物体内高度保守。该通路与细胞生长,分化和发育有关,其功能在早期胚胎发育、组织稳定性维持和器官大小控制及再生等均起到关键作用。它通过调节组织生长和细胞分化,被认为是组织稳态和器官大小的中心调节通路。该通路与它的激酶组分之一（Hippo,或哺乳动物中的MST1/2）同名,由于在通路突变实验中观察到的过度生长表型而得名。其主要是通过对其成员之间上下游蛋白的转录调节信号传递,招募及共激活等发挥作用。YAP是Hippo信号通路的关键蛋白,该蛋白自身结构中无DNA结合结构域。研究表明,一旦Hippo对应的通路出现异常情况,YAP就会进入到细胞核内部;然后和Hippo信号通路末端关键调节蛋白,转录增强因子TEADs（Transcriptional enhancer associated domain family members）进行结合,形成异源二聚体复合物,进而直接影响下游基因自身的转录。TEADs能招募YAP/TAZ、VGLL等转录共激活因子,可调控包括CTGF、Cyr61、AXL、Myc、Gli2和BIRC5等不同的促癌基因表达,并且也在肿瘤标志物间皮素激活过程中发挥了关键作用。众多临床数据分析结果表明,TEAD是非常关键的肿瘤标志物。TEAD各个家族成员在结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等多种不同的癌症中都有很高的表达,进一步的分析发现其表达的异常和突变也是重要的临床不良预后的标志。组蛋白的乙酰化修饰也是表观遗传中基因转录调控的重要机制之一。组蛋白翻译后修饰可以在真核生物体内引起的染色质结构发生变化,改变染色质的组成造成染色质重塑,染色质的重塑可以改变转录因子与其染色质DNA的结合从而启动或者抑制相关基因的表达。在众多表观遗传调控中,组蛋白的乙酰化修饰调控在基因表达调控的过程中起到了关键的作用。针对组蛋白乙酰化的修饰发生过程进行探究表明,大多数情况下经过组蛋白乙酰化酶“Writer”来催化组蛋白上的赖氨酸乙酰化,激活基因转录再由去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDACs）Eraser来去除乙酰化。Bromodomain（BRD）家族的蛋白可以对其特定的赖氨酸乙酰化修饰进行识别,是可以与其结合的唯一的结构域,包含这个结构域的蛋白被叫做“溴蛋白家族”。其家族成员根据其结构和功能的相似性,有8个家族。由于组蛋白乙酰化状态的失衡与肿瘤发生密切相关,近几年来,对其抑制剂的发现与开发,发展迅速。该靶标家族涉及包括癌症等多种重大疾病,靶向该家族蛋白的多个药物都已经进入临床试验。本论文基于靶向调控相关转录蛋白的小分子抑制剂的发现,以Hippo通路重要转录因子TEAD及组蛋白赖氨酸乙酰化的识别蛋白BET家族BD2,这两个具有潜在成药性的新型靶标为切入点,结合药物设计,体外高通量化合物的筛选,化学合成和改造以及药理学等手段展开研究。本论文的第一部分工作,靶向TEAD-YAP相互作用建立并优化基于Alpha Screen技术的高通量筛选平台,并一步通过多种生物实验验证,获得其先导化合物。首先,通过优化pH条件、盐浓度、表面活性剂等理化条件,获得了具有较高通量和灵敏性的高通量筛选体系,为发现靶向TEAD-YAP相互作用PPI界面的小分子抑制剂提供方法基础。进而,我们运用该方法,对本实验室内部的天然产物库进行高通量筛选,获得苗头化合物DCTEAD06,共IC50值为19.9 ±3.0 μM。接着,通过假阳性排除,并利用蛋白热迁移实验、表面等离子共振等实验,确证TEAD4与DCTEAD06的结合。接着,通过细胞实验,证明DCTEAD06可以抑制结肠癌细胞HCT116的增殖,诱导细胞凋亡。然后,运用萤光素基因报告实验,发现了其可以抑制TEADs对下游靶基因的转录活性。因此,在这一章工作中我们开发和优化了可以对TEAD4-YAP结合进行高通量小分子抑制剂筛选的Alpha Screen方法平台,并且发现了新型骨架结构的TEAD4-YAP的小分子抑制剂化合物。通过体外结合模式和细胞水平作用探索,为下一步化合物的结构和活性的优化提供了有效的指导,并且也为其他TEAD家族的小分子抑制剂化合物提供了可靠的筛选技术平台。在之前的工作中我们对TEAD4-YAP的抑制剂进行了筛选发现,但是由于该界面空间狭长且亲和力较高,往往现有的小分子抑制剂的活性不高,并且改造的难度较大。近几年来研究发现TEADs在生理条件下其保守半胱氨酸位点会发生自棕榈酰化,TEADs的自棕榈酰化对其稳定性和功能非常重要。因此,我们在第二部分的工作中靶向TEADs自棕榈酰化位点,开展其先导化合物发现与验证研究。首先,利用基于活性的蛋白谱技术Click实验对本实验室内部的共价化合物库进行了筛选,获得了具有TEAD1/3选择性骨架新颖小分子抑制剂DC-TEADin1072。其次,利用基于蛋白与小分子共价对接方式,分析蛋白和小分子的结合模式。进而,分析了 TEADs家族蛋白内部存在的氨基酸差异,最终获取了 TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂DC-TEADin1072。该抑制剂为新型TEAD1和TEAD3选择性共价抑制剂,IC50分别为0.61±0.02 μM和0.58±0.12 μM。经质谱分析和蛋白位点突变检测证实该蛋白在TEAD1 C359和TEAD3 C371位点与半胱氨酸结合。最终,在斑马鱼的动物实验表明,该类化合物对动物的发育产生明显影响。基于上述发现的TEAD1和TEAD3的双靶点抑制剂,我们通过序列和晶体结构比对等多种方式,开展基于结构的药物化学优化,最终得到了选择性更强专一的TEAD1或者TEAD3抑制剂。根据文献,我们发现对TEAD3的生理功能研究较少,现阶段缺乏一个选择性高活性较好的化学探针,以探索TEAD3的功能。我们对DC-TEADin1072结构进行了化学优化得到了 DC-TEAD3in03化合物。为进一步证实TEAD3在细胞中的选择性抑制作用,用GAL4-荧光素报告基因验证TEAD3对GAL4-TEAD1-4荧光化信号的抑制作用,其在TEAD3活性为1.15 μM。动物实验表明,DC-TEAD3in03与TEAD3的共价结合抑制了斑马鱼的生长,并证实TEAD3与发育功能有关。本部分的工作,我们基于化合物的筛选发现TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂,并以此为起点针对TEADs家族晶体结构的分析与比较,应用药物化学优化发现了选择性TEAD3的共价小分子抑制剂,在细胞内也可以实现对TEAD3选择性的转录活性抑制。以斑马鱼为模型将TEAD1和TEAD3双靶点抑制剂作为对照,研究其对发育的影响,发现的抑制TEAD1/3可以抑制影响斑马鱼整体的生长速率,TEAD3抑制剂特定的影响其尾鳍的生长速率。证明了TEAD3生物发育方面的重要性,也揭示了TEADs家族不同成员调控的基因的差异,对TEADs其他家族成员选择性抑制剂的开发和不同转录因子的具体生理病理功能提供了化学探针。本论文最后的部分内容主要涉及到组蛋白乙酰化识别因子BET家族BD2选择性抑制剂作用机制的研究。组蛋白赖氨酸乙酰化识别因子Bromodomain是非常重要的癌症治疗靶标,其中以BET家族为代表,主要包括BRD2,BRD3,BRD4和BRDT为家族成员。BET家族的蛋白包含了BD1和BD2两个Bromodomain结构域。近年来,选择性抑制BET BD2成为一种很有前途的药物发现策略。尽管在这一领域取得了重大进展,但对配体—蛋白复合物结构、基因表达改变的差异以及选择性BET BD2抑制剂体内具体发挥作用的机制研究仍然很少。我们建立了AlphaScreen方法来检测和验证抑制剂的活性和选择性倍数。通过化合物与BD1和BD2高分辨率共晶体结构阐明其具体的结合模式,为BET家族BD2选择性提供了坚实的结构基础。非常值得关注的我们也第一次确定了外环芳香胺类化合物是一类新型的选择性抑制BET BD2的骨架,这为改造合成新BET BD2选择性抑制剂提供了思路。此外小鼠肿瘤模型中显示,BY27显示出67%的肿瘤生长抑制作用,与目前处于Ⅱ期临床试验中的pan BET抑制剂Ⅰ-BET762相当,它在高剂量下对小鼠的毒性更小。这些结果表明靶向选择性BET BD2抑制剂的开发具有极佳的体内抗肿瘤活性和安全性。
郭丁预[3]（2021）在《小麦TaCKX4、TaNAC1基因TILLING突变体的鉴定与功能分析》文中研究表明细胞分裂素（CTK）作为一类腺嘌呤衍生物,是参与调控植物生长发育过程最重要的植物激素之一,目前已被研究证实有许多重要的生理功能,如促进植物细胞分裂分化、延缓衰老、提高籽粒产量、调控非生物胁迫等,能够被细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase,CKX）不可逆降解,且具有很强的专一性。小麦作为世界三大作物之一,是我国主要的粮食来源,研究小麦CKX基因的功能对培育高产、优质、适应性强的小麦品种、优化小麦种质资源和国家粮食安全具有极其重要的意义。本研究基于实验室前期构建的济麦22号TILLING突变体库,在其全外显子捕获测序数据库中查找了TaCKX4、TaNAC1基因的有效突变位点并进行鉴定,对鉴定成功的部分突变株系进行了多个生理指标和CKX相关基因表达量的分析,初步分析并比较了各突变株系的生理功能和性状,总结了TaCKX4和TaNAC1基因的调控关系。同时,本研究还基于实验室前期构建并优化的HRM突变体筛选体系,以TaCKX1为目的基因,进行了筛选应用。主要实验结果如下:1.济麦22号小麦TILLING突变系TaCKX4、TaNAC1基因突变位点的检测为研究小麦TaCKX4、TaNAC1基因的功能,在本实验室构建的济麦22号TILLING突变群体全外显子捕获测序数据库中查找对应的突变株系,共获得6个TaCKX4突变株系和8个TaNAC1突变株系,通过进一步分析检测,成功鉴定出4个TaCKX4突变株系和6个TaNAC1突变株系,均存在G→A和C→T的单碱基突变位点。为进一步分析小麦TaCKX4、TaNAC1基因突变对小麦生长的影响以及研究小麦CKX基因功能奠定了基础。2.TaCKX4、TaNAC1突变体生理功能分析和基因表达分析选取实验前期鉴定成功的部分突变株系（JM58、JM73、JM105、JM108、JM112和JM286）分别进行生理指标和基因表达量的分析,并与野生型JM22进行比较。分别用0、2、4、6 mmol/L硫酸锌溶液处理不同突变株系的小麦幼苗,并测定其根长势、植株高度、叶绿素含量、根细胞活力后发现:不同浓度硫酸锌对小麦根长势、植株高度的影响为高浓度促进、低浓度抑制的趋势,且高浓度硫酸锌（6 mmol/L）对JM112和JM286影响较为明显;叶绿素含量呈现随硫酸锌溶液浓度增加逐渐下降的趋势,且2 mmol/L硫酸锌溶液处理下叶绿素含量有增加的可能,同时发现突变株系JM73、JM108在无硫酸锌溶液处理时相比其他株系所含的基础叶绿素含量较高;低浓度硫酸锌溶液（0、2 mmol/L）处理对小麦根细胞活力的影响不大,且JM58、JM73和JM108相比其他株系根细胞活力更好。分别用0%、20%、30%、40%PEG处理不同突变株系的小麦幼苗一周左右,并测定其PSⅡ最大光合效率（FV/Fm）、光化学淬灭系数（qp）、PSⅡ实际光合效率（Y（Ⅱ））后发现:FV/Fm、qp、Y（Ⅱ）在重度PEG干旱胁迫（40%）下降幅最明显,大致趋势为随PEG干旱胁迫浓度的增加荧光参数下降,JM22和JM286的荧光动力学参数降幅不显着,抗旱性能良好。重度干旱胁迫（40%PEG）处理不同突变株系的小麦幼苗,并分析其在0、0.5、1、2、12 h时TaNAC1和TaCKX4等基因的表达量变化后发现:在受到重度干旱胁迫的12 h内,所有小麦株系的TaNAC1基因表达量均轻微下调后恢复正常水平,TaCKX4和TaCKX5基因表达量则明显上调。通过以上生理指标和基因表达量分析初步发现野生型JM22、突变株系JM73和JM105等有较好的抗旱性,可以作为改良小麦种质资源的品系继续发掘其潜力。3.HRM筛选突变体平台的初步应用基于实验室前期建立并优化的HRM突变体筛选平台,以小麦产量性状相关的TaCKX1为目标基因,对随机选取的8个济麦22号TILLING突变株系进行筛选,分别成功地在7A019和7A106突变株系中筛选出G→A和A→G的单碱基突变。利用HRM突变体筛选平台对TaCKX1基因的筛选应用,验证了该平台的运行情况,为后续筛选TILLING突变体库的其他基因提供了技术支持。
王云鹤[4]（2021）在《拟南芥花期调控基因SSF自然变异鉴定与功能解析》文中提出开花是植物生命周期中从营养生长向生殖生长的重要转变。开花时间是一个复杂性状,据报道有许多因子参与开花时间的调控。但目前为止,依旧有许多调控因子未被鉴定,生物学功能也未得到解析。因此,在本研究中,我们利用生物信息学、遗传学、分子生物学和生物化学等手段,对拟南芥自然群体的花期变异进行了筛选,鉴定到一个花期调控基因SSF（Sister of FCA）的自然变异,并依托相应的突变体材料,开展了分子机制研究。主要结果如下:1、我们检测了102个拟南芥自然生态型春化处理前后的FLC表达,并以此数据进行了GWAS分析。同时,我们以花期存在显着差异的自然生态型为亲本,构建了含有284个株系的F2群体,并统计了群体的花期数据,利用QTL分析方法鉴定到了3个主要QTL位点。其中一个位于2号染色体末端的QTL信号与GWAS获得的SNP位点共定位。2、生物信息学分析表明SSF是Chr2-QTL区间的候选基因。突变体表型鉴定说明SSF正向调控FLC表达。组织表达模式和亚细胞定位证明SSF定位在细胞核中,且在花器官中高表达。遗传途径分析表明SSF作为新的因子参与自主途径调节开花时间。此外,转录活性分析和Ch IP实验说明SSF在转录水平上调节FLC基因表达。SSF等位变异转基因株系（SSF414N/ssf-2和SSF414D/ssf-2）的FLC表达和开花时间有显着差异。3、通过蛋白IP-MS技术,我们筛选到了一个SSF相互作用蛋白:泛素E3连接酶CUL1,利用Y2H系统、BIFC系统、体外Pull-down和体内Co-IP等技术验证了这两个蛋白间的互作,并发现SSFN414D等位变异能影响其与CUL1的互作强度。4、与野生型相比,cul1-1突变体表现出早花表型,FLC被下调表达,FT上调。定性和定量蛋白泛素化实验表明CUL1可以促进SSF蛋白降解,CUL1还可以与SSF同源蛋白FCA互作并抑制其蛋白积累。此外,N414D的非同义突变显着影响SSF蛋白泛素化程度,从而调控SSF蛋白稳定性并影响植物开花时间。5、瑞典南北地区存在显着的气候差异,研究发现SSFN414D等位基因在瑞典南北也存在显着的地理分布差异,推测SSF自然变异可能与植物在南北两地的环境适应性有关。此外,进化分析发现SSF只存在于双子叶植物中,而其同源蛋白FCA存在于单子叶和双子叶植物中,N414D的自然变异发生在单双子叶分化之后,SSF414N只存在于少数拟南芥自然生态型中。综上所述,本研究通过GWAS、QTL相结合的方法筛选参与花期调控的候选基因SSF,并深入研究了其功能与其通过与泛素化途径互作调控FLC基因表达的分子机制,并探究了SSF自然变异在植物环境适应性方面发挥的功能。
孙琳[5]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中研究说明棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
张飞[6]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中研究指明睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
张晶晶[7]（2021）在《陆地棉GhHDA5和GhHDA6基因在棉花早熟性中的功能分析》文中提出棉花是重要的纤维作物,在我国农业经济中具有重要作用。棉花早熟性是一个复杂的农艺性状,也是棉花育种的重要目标之一。目前对棉花研究大多都集中于棉花纤维品质、产量等,而对于棉花早熟性研究较少,本研究旨在挖掘棉花早熟相关基因,并对其功能进行分析,主要结论如下:1.本研究在实验室之前的基础上,针对一个开花相关主效QTL,从重组自交系群体中挑选RIL174为母本,G2005为轮回亲本构建一个包含有828棵单株的BC1F2次级分离群体。调查该群体的开花期符合正态分布。在候选区段附近筛选到13对多态性SSR标记,对BC1F2群体进行基因型鉴定,利用加性-完备区间作图法进行QTL定位。检测到在D03染色体上存在一个主效QTL（q FT-D03）,位于基因组32.8-34.82 Mb之间,LOD值为17.57,解释表型变异9.87%。对区段内68个基因进行功能注释结合表达模式分析,挑选出来一个棉花开花相关基因Gh HDA6。组织表达模式分析表明Gh HDA6基因在花器官中具有较高的表达水平,而且在两个亲本花芽分化时期存在显着差异。Gh HDA6过表达转基因拟南芥比野生型开花提前,而病毒诱导Gh HDA6基因沉默株系跟对照VA植株相比表现出了晚花的表型。通过筛选早熟相关酵母AD质粒文库,检测到两个基因Gh MSI4和Gh NF-YC2基因与Gh HDA6相互作用,这两个基因表达模式相似,且都在棉花早晚熟材料中差异表达,推测两个基因与Gh HDA6基因相互作用共同调控棉花开花时间。2.为了鉴定棉花早熟性状果枝始节位相关QTL和基因,本研究利用重组自交系RIL182为基础材料,G2005为轮回亲本,构建一个包含有278棵单株的BC4F2群体。在现蕾期调查BC4F2群体的果枝始节位,从中挑选极端单株构建两个DNA混池,结合BSA测序技术,对果枝始节位这一早熟性状进行QTL定位。通过QTL-seq和共定位方法鉴定到两个关键QTL位于果枝始节位的热点区域。通过表达模式分析和VIGS试验鉴定到两个跟果枝始节位和开花相关的基因Gh APL和Gh HDA5,二者在两个亲本花芽分化时期具有显着差异。病毒诱导Gh APL和Gh HDA5基因沉默,相比于对照VA植株,沉默植株表现出了果枝始节位升高,开花延迟的表型。3.本研究鉴定到两个棉花组蛋白去乙酰化酶Gh HDA6和Gh HDA5与早熟性状相关,表明RPD3类型的去乙酰化酶在棉花早熟性方面起重要作用。通过全基因组鉴定,在9个物种中共检测到108个RPD3基因。根据拟南芥的分类,这些基因被分为四个亚组。通过对54个棉花RPD3基因的外显子-内含子结构和保守基序分析,四个亚家族之间存在显着差异,但在同一分支上高度保守。RPD3基因在二倍体棉种和四倍体棉种中的基因数目和染色体分布相对保守。基因表达模式分析显示,大部分Gh RPD3基因在花器官中具有较高的表达水平,而且低温、高温、PEG和Na Cl四种非生物胁迫可以不同程度的诱导RPD3基因的表达。在棉花花芽分化阶段,5个RPD3基因在早熟棉中50的表达水平显着高于晚熟棉国欣11号。此外,Gh RPD3基因可以响应外源激素Me JA和ABA的处理。这些结果为今后分析棉花早熟的遗传机制和选育早熟品种奠定了基础。
宋梦秋[8]（2021）在《水稻小粒窄叶基因GSNL4的精细定位与基因克隆》文中研究表明ARGONAUTE1（AGO1）蛋白通过结合成熟小干扰RNA（si RNA）或micro RNA（miRNA）来调控植物的生长发育。水稻OsAGO1a,b,c和d主要与已知的miRNA结合,在这四个OsAGO1中,OsAGO1b可能是调节水稻生长发育的主要参与者。但是,目前通过正向遗传学对OsAGO1b的研究还未报道。本研究通过EMS诱变粳稻品种武运粳21,获得了一个小粒窄叶突变体,将其命名为gsnl4（grain size and narrow leaf4）。本文主要研究结果如下:1、gsnl4突变体表现出籽粒变小、叶片变窄、茎秆变细、结实率降低和根系变少等多种发育表型。2、组织学分析表明,gsnl4突变体的叶片和茎秆中的维管束数量、茎秆和颖壳细胞的大小和数量均显着减少。3、遗传分析表明,gsnl4小粒窄叶表型受单个隐性核基因的控制。4、通过图位克隆的方法,我们将GSNL4精细定位至4号染色体的42 kb的区间内。5、对野生型和gsnl4进行测序,比对发现突变体gsnl4中LOC＿Os04g47870（OsAGO1b）基因的13746位碱基发生了由G到A的单碱基突变,导致OsAGO1b蛋白的Piwi结构域中的一个丝氨基酸（Ser）突变为天冬氨酸（Asn）。有趣的是,我们发现该突变位点与拟南芥突变体ago7-15中的At AGO7为同一突变位点。6、以野生型粳稻品种武运粳21为背景敲除LOC＿Os04g47870基因,敲除株系表现为明显的窄叶、小粒及结实率显着降低等特征,表明该基因是小粒窄叶相关的目标基因GSNL4。7、亚细胞定位表明,GSNL4在细胞质和细胞核中表达。8、GUS染色和实时定量PCR结果表明,GSNL4在水稻的不同组织中均表达,且在幼穗中高表达。9、miRNA-seq分析显示,突变体gsnl4中的miRNA大约有29个显着上调,23个显着下调;野生型和突变体gsnl4之间差异表达的miRNA的靶基因大多数与植物激素信号转导途径、糖代谢途径、花药和花粉发育相关。10、茎环PCR分析,与野生型相比,突变体gsnl4中一些成熟miRNA的表达量上调,而它们的一些靶基因的表达显着上调。11、与野生型相比,突变体gsnl4根尖中的内源IAA含量下降,并且通过实时定量PCR分析,突变体gsnl4中大多数与叶片发育及生长素合成和运输相关基因的转录表达发生紊乱。本研究通过正向遗传学的方法首次获得的OsAGO1b突变体,揭示了OsAGO1b不仅通过控制细胞分裂和扩增来调节器官发育,而且在调节IAA合成和转运中也起着重要作用。并且确定了Piwi结构域中的S810N残基在水稻与拟南芥中非常保守,这为进一步剖析AGO1/7的化学功能提供了遗传学证据,并为进一步研究OsAGO1b的功能提供了良好的遗传学材料。
何冬[9]（2021）在《影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位》文中研究说明水稻是重要的粮食作物和植物基因组学研究的模式植物,发掘影响水稻穗发育的基因对解析穗形态建成具有重要的意义。水稻穗发育是受多基因调控的复杂生物学过程,而且是影响水稻产量的关键因素之一。本研究通过筛选T-DNA插入突变体库,鉴定了一个控制顶端穗发育的重要基因RBH1（Rice panicle Bale Head 1）,RBH1基因突变导致穗发育退化。遗传学和生化分析表明RBH1基因编码果胶裂解酶,介导了分生组织细胞活性氧的清除。为了发掘更多控制穗发育的关键基因,通过筛选EMS突变体共鉴定了10份穗突变体。采用Mutmap方法对其中的部分材料进行了基因初定位。本研究主要工作包括以下方面:1.RBH1基因的克隆和功能分析1.1 RBH1基因的克隆与表达模式分析本研究鉴定了2份RBH1基因的突变体,分别命名为rbh1-1和rbh1-2,它们表现为类似的突变缺陷,以rbh1-1为材料,开展详细研究。rbh1-1呈现出顶端穗缺陷,且部分顶端穗退化为细丝状。相比于野生型（wild type,WT）,rbh1-1二次枝梗数及每穗粒数均显着减少。在花器官原基形成时期,rbh1-1表现为明显的雄蕊雌蕊缺陷,穗生长速率明显降低,说明RBH1可能在穗发育阶段发挥功能。通过TAIL-PCR技术证实rbh1-1突变体中T-DNA元件插入在水稻10号染色体LOC＿Os10g31910基因内,LOC＿Os10g31910基因注释为果胶裂解酶。互补测验结果表明rbh1-1突变体背景的转基因阳性植株恢复野生表型。这一结果说明,LOC＿Os10g31910基因的突变导致了rbh1-1突变体穗退化的突变表型,LOC＿Os10g31910即为本研究中的RBH1基因。qRT-PCR结果表明RBH1是一个组成型表达的基因,在各组织中均有表达。原位杂交结果表明RBH1 m RNA在幼穗发育中逐渐积累,并且在小花原基形成时期达到峰值。1.2 RBH1基因的功能分析RBH1蛋白与百脉根Lj NPL蛋白及拟南芥中的PMR6蛋白序列相似而且包含相同的功能结构域。体外酶活实验证明RBH1原核诱导蛋白具有分解果胶的能力。免疫染色技术结果显示在rbh1-1穗组织中,果胶类物质含量明显高于野生型,说明野生型植株体内的RBH1蛋白具有降解果胶的功能。二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）染色结果确定,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在rbh1-1突变体中过度累积;基因表达分析显示rbh1-1突变体中ROS清除相关基因出现明显上调表达。说明RBH1基因突变会导致ROS积累水平显着增加。使用不同浓度的H2O2作为外源施加的ROS处理中花11号（ZH11）愈伤组织,其中2 m M H2O2能够高效促进愈伤组织的分化。与之对应ZH11愈伤组织经过10 m M和20 m M H2O2的处理后分化水平明显降低。这些结果说明ROS水平的高低影响细胞分化,适宜的ROS浓度才能保障细胞的正常分化。RBH1基因可能通过影响细胞ROS水平进而调控穗形态建成中的细胞分化。2.水稻穗发育基因的定位基于课题组前期创制的EMS突变体库,鉴定了10份穗突变体。本研究通过Mutmap技术对5份穗突变材料进行基因定位,初步获得4份穗突变体的候选基因。其中F13基因位于2号染色体,编码一个含AP2结构域的功能蛋白,f13突变体出现严重的穗发育缺陷并最终表现为极端矮化。ricexp公共数据库（https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html）表达谱的数据表明F13在穗发育过程中特异表达。f13突变体中F13蛋白翻译提前终止,引起F13蛋白结构改变。这些结果说明F13基因突变可能导致f13突变体的穗发育缺陷和极端矮化的表型。综合本论文研究结果,通过T-DNA标签法克隆了影响水稻穗退化的功能基因RBH1,RBH1编码一个果胶裂解酶。该基因参与了水稻幼穗分化过程中细胞活性氧的平衡,影响穗形态建成。同时,利用Mutmap技术初步定位了4个穗形态建成的候选基因,为后续穗发育研究积累了遗传资源。
刘畅[10]（2021）在《结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL》文中提出水稻（Oryza sativa L.）是我国主要的粮食作物之一。稳产是保障粮食安全的基础。近年来,水资源的消耗和劳动力的转移成为水稻增产的主要限制因素。以省力、省工和低成本为特点的直播栽培形式有助于缓解水资源和劳动力稀缺的现状。但直播稻依然存在部分问题,限制了其广泛应用。比如,出苗困难、幼苗期杂草多、中后期易倒伏等。其中出苗困难问题亟需解决。研究表明,中胚轴长度（Mesocotyl length,ML）是影响旱直播水稻出苗和早期幼苗活力的重要性状,中胚轴伸长是幼苗迅速破土的关键动力。因此,发掘中胚轴伸长相关位点,解析其遗传机制,选育长中胚轴品种是促进旱直播技术推广最为经济和有效的方式。本研究以短中胚轴材料‘IR 145’（0.18 cm）为共同母本,分别与长中胚轴材料‘Basmati 385’（3.85 cm）、‘Changai’（4.75 cm）和‘BR 11’（4.60 cm）进行杂交,构建获得三个F2群体。对每个群体及双亲本进行中胚轴长度测定。于每个F2群体分别选择50个中胚轴极长个体和50个中胚轴极短个体构建极端池,并开展深度重测序（50×）。利用Δ（SNP-index）和G-value两种方法发掘中胚轴伸长显着位点。在IR 145×Basmati 385和IR 145×BR 11的F2群体中,未鉴定出显着的中胚轴伸长相关位点。利用IR 145×Changai的F2群体,在第1、3和7号染色体上共发掘到三个中胚轴伸长相关位点（q ML1、q ML3、q ML7）。q ML1（38.07 Mb～40.29 Mb）区间总长2.22 Mb,峰值点位于38.5 Mb。q ML3（29.56 Mb～33.28 Mb）区间总长为3.72 Mb,峰值点位于31.29 Mb处。q ML7（17.11 Mb～27.93 Mb）区间总长为10.82 Mb,峰值点位于23.36 Mb处。其中,q ML1和q ML3为本研究的有效目标位点。分别在q ML1和q ML3两个区间内开发6个和10个KASP标记,对184个F2株系开展连锁分析,将q ML1缩小至38.19 Mb～38.38 Mb,q ML3缩小至28.89 Mb～31.03Mb。结合连锁分析和基因注释结果,在q ML1和q ML3中初步筛选获得26个候选基因。采用q RT-PCR对上述基因进行亲本间表达模式验证,结果表明LOC＿Os01g65850、LOC＿Os01g65880、LOC＿Os01g65902、LOC＿Os01g65970、LOC＿Os01g65986、LOC＿Os01g66000、LOC＿Os01g66010、LOC＿Os01g66070、LOC＿Os03g52450、LOC＿Os03g56060、LOC＿Os03g58290、LOC＿Os03g58300、LOC＿Os03g58320、LOC＿Os03g56050和LOC＿Os03g57640在长中胚轴品种‘Changai’和短中胚轴品种‘IR 145’中的表达量呈现显着差异,推测上述15个基因为候选基因。这些基因与植物激素的调控和细胞分裂相关机制有关。针对q ML1的变异位点开发了一个InDel标记,利用该标记扫描含有98份材料的育种群体,并开展基因型与表型的显着性检验,发现该标记可区分长短中胚轴材料,后续可应用于长中胚轴水稻育种。本研究为进一步精细定位中胚轴伸长相关基因,解析其遗传机制提供了遗传和材料基础,开发的分子标记对选育长中胚轴品种提供了有利工具。
二、Determining Cotton Fiber Gene Function via Structuring of Mutant Populations for High-Throughput Reverse Genetics（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Determining Cotton Fiber Gene Function via Structuring of Mutant Populations for High-Throughput Reverse Genetics（论文提纲范文）
（1）油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略术语词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 导言 |
| 1.2 高含油量育种的策略 |
| 1.3 种胚脂肪酸合成 |
| 1.4 脂肪酸降解 |
| 1.4.1 脂肪酸降解的基本途径 |
| 1.4.2 GDSL脂酶以及种子脂肪酸消减基因(Seed fatty acid reducer,SFAR) |
| 1.4.3 Patatin-like lipase脂酶 |
| 1.5 TILLING-定向诱导基因组局部突变技术 |
| 1.5.1 TILLING的基本原理 |
| 1.5.2 TILLING技术在植物研究中的应用和前景 |
| 1.6 CRISPR/Cas介导的基因编辑技术 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas系统的基本原理 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas系统在作物改良领域的应用和前景 |
| 1.7 调控作物复杂数量性状相关基因的发掘 |
| 1.8 全基因组关联分析在油菜功能基因发掘中的应用 |
| 1.9 本研究的目的、意义以及技术路线 |
| 第二章 甘蓝型油菜GDSL脂酶基因的全基因组分布及Seed Fatty Acid Reducer基因的鉴定 |
| 2.1 导言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 BnGDSLs在甘蓝型油菜基因组上的鉴定 |
| 2.2.2 BnGDSLs的系统进化分析和共线性分析 |
| 2.2.3 转录组数据分析 |
| 2.2.4 候选BnSFARs的获取 |
| 2.2.5 BnSFARs在种子发育过程中的表达分析 |
| 2.2.5.1 种子材料和发育时期选定 |
| 2.2.5.2 BnSFARs的特异引物设计 |
| 2.2.5.3 RT-qPCR实验步骤 |
| 2.2.5.4 表达数据分析 |
| 2.2.6 油菜种子含油量和油酸含量的测定 |
| 2.2.7 分布于BnSFARs的SNPs鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BnGDSLs的全基因组鉴定分析 |
| 2.3.2 种子发育时期的BnGDSLs表达分析 |
| 2.3.3 BnSFARs的筛选 |
| 2.3.4 种子中BnSFARs的表达模式分析 |
| 2.3.5 BnSFARs的序列变异对种子含油量以及脂肪酸组分的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Seed Fatty Acid Reducer基因的TILLING分析及多突变位点的聚合效应 |
| 3.1 导言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 目的基因的选择 |
| 3.2.2 M_2代EMS突变体的TILLING筛选 |
| 3.2.3 EMS单突变体和双突变体的选育 |
| 3.2.4 油菜生长条件 |
| 3.2.5 种子含油量测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BnSFAR1和BnSFAR4 的诱变分析 |
| 3.3.2 EMS突变体的种子含油量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CRISPR/Cas9系统介导的甘蓝型油菜Seed Fatty Acid Reducer基因突变对种子含油量的影响 |
| 4.1 导言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 CRISPR/Cas9 载体构建 |
| 4.2.1.1 靶位点选择和引导RNA合成 |
| 4.2.1.2 pChimera重组载体的构建 |
| 4.2.1.3 pCas9-TPC重组载体的构建 |
| 4.2.2 油菜的转化 |
| 4.2.3 突变体鉴定 |
| 4.2.4 转基因植株材料和生长环境 |
| 4.2.5 突变体植株种子含油量测定 |
| 4.2.6 种子萌发和幼苗活力检测 |
| 4.2.7 油脂积累以及调动模式分析 |
| 4.2.8 油体鉴定分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 BnSFARs靶位点确定及相应sgRNA设计 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 转基因植株突变位点的鉴定 |
| 4.3.4 bnsfars突变体植株的种子含油量和千粒重分析 |
| 4.3.5 bnsfars突变体植株种子的油体鉴定和分析 |
| 4.3.6 bnsfars突变体的种子油脂积累分析 |
| 4.3.7 bnsfars突变体种子的活力分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全基因组关联分析进一步发掘调控种子含油量的相关基因 |
| 5.1 导言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 油菜种质材料和种植条件 |
| 5.2.2 油菜种子含油量测定和表型分析 |
| 5.2.3SNPs鉴定和全基因组关联分析 |
| 5.2.4 顺式作用元件预测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 种子含油量的表型变异分析 |
| 5.3.2 种子含油量的全基因组关联分析 |
| 5.3.3 候选基因的筛选 |
| 5.3.4 Bna.PTL.C07对种子含油量的影响分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（2）靶向调控相关转录蛋白的先导化合物的发现及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 转录调控的概述 |
| 1.2 Hippo信号通路 |
| 1.2.1 Hippo信号通路的组成 |
| 1.2.2 Hippo信号通路的生理功能 |
| 1.2.3 Hippo信号通路与癌症 |
| 1.3 组蛋白乙酰化修饰 |
| 1.3.1 组蛋白乙酰化转移酶 |
| 1.3.2 组蛋白去乙酰化转移酶 |
| 1.3.3 组蛋白乙酰化识别因子 |
| 1.3.4 组蛋白乙酰化修饰与癌症 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于TEAD4-YAP相互作用的Alpha Screen高通量筛选体系建立及先导化合物发现及验证 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 转录因子TEADs |
| 2.1.2 TEAD-YAP与肿瘤的关系 |
| 2.1.3 TEAD-YAP抑制剂研究进展 |
| 2.1.4 高通量筛选与化合物 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 TEAD4蛋白的载体构建 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 |
| 2.2.6 重组质粒的扩增与鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 TEAD4-YBD的表达及目的蛋白纯化 |
| 2.2.9 互作蛋白YAP多肽片段合成 |
| 2.2.10 不同缓冲液的pH环境对蛋白质自身热稳定性的影响 |
| 2.2.11 建立基于Alpha Screen技术的TEAD-YAP互作实验 |
| 2.2.12 Alpha Screen实验方法的建立及优化 |
| 2.2.13 Z-factor的测定 |
| 2.2.14 高通量化合物筛选 |
| 2.2.15 表面等离子共振实验 |
| 2.2.16 对接实验 |
| 2.2.17 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.18 荧光定量PCR实验 |
| 2.2.19 细胞增殖实验 |
| 2.2.20 细胞凋亡实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 TEAD4蛋白的表达、纯化 |
| 2.3.2 TEAD4-YAP Alpha Screen实验方法的建立与优化 |
| 2.3.3 不同浓度DMSO对反应稳定性的影响 |
| 2.3.4 不同DMSO浓度对高通量实验的稳定性影响 |
| 2.3.5 高通量筛选结果 |
| 2.3.6 表面等离子体共振 |
| 2.3.7 DCTEAD06和TEAD4的结合模式分析 |
| 2.3.8 DCTEAD06抑制TEAD转录活性 |
| 2.3.9 DCTEAD06对下游靶基因的影响 |
| 2.3.10 DCTEAD06抑制结肠癌细胞增殖、凋亡 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 TEADs棕榈酰化位点共价化合物的发现与验证 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 TEADs家族 |
| 3.1.2 TEAD蛋白结构研究 |
| 3.1.3 TEAD棕榈酰化 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TEADs家族蛋白的的表达与纯化 |
| 3.2.2 半胱氨酸选择性分析 |
| 3.2.3 化学合成 |
| 3.2.4 利用“Click反应”棕榈酰化体外酶活实验 |
| 3.2.5 质谱 |
| 3.2.6 蛋白热迁移实验 |
| 3.2.7 共价对接 |
| 3.2.8 报告基因实验 |
| 3.2.9 细胞内蛋白热迁移实验 |
| 3.2.10 斑马鱼相关实验 |
| 3.2.11 化合物库 |
| 3.2.12 材料与试剂 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TEADs棕榈酰化共价化合物库的筛选 |
| 3.3.2 化学生物学初步确证 |
| 3.3.3 结合模式 |
| 3.3.4 DC-TEADin1072细胞实验验证 |
| 3.3.5 报告基因实验 |
| 3.3.6 斑马鱼发育实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 TEAD3选择性共价化合物的发现与验证 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.1.1 TEAD1-4蛋白与肿瘤的关系 |
| 4.1.2 TEADs棕榈酰化口袋现有抑制剂的发展 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TEADs家族蛋白的的表达与纯化 |
| 4.2.2 半胱氨酸选择性分析 |
| 4.2.3 基于“点击化学”原理的棕榈酰化体外酶活实验 |
| 4.2.4 蛋白热迁移实验 |
| 4.2.5 质谱 |
| 4.2.6 共价对接 |
| 4.2.7 化学合成 |
| 4.2.8 报告基因实验 |
| 4.2.9 细胞内蛋白热迁移实验 |
| 4.2.10 斑马鱼相关实验 |
| 4.2.11 晶体培养与生长 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 TEADs棕榈酰化口袋保守性分析 |
| 4.3.2 药物化学改造 |
| 4.3.3 DC-TEAD3in03细胞实验验证 |
| 4.3.4 报告基因实验 |
| 4.3.5 斑马鱼发育实验 |
| 4.3.6 TEADs晶体结构解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 靶向BET家族BD2选择性化合物验证 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.1.1 BET蛋白的结构 |
| 5.1.2 BET家族蛋白与癌症 |
| 5.1.3 BET家族小分子抑制剂的发展 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 BRD4-BD1蛋白的表达和纯化 |
| 5.2.2 BRD4 BD1蛋白结晶样品的准备 |
| 5.2.3 BRD4-BD1蛋白与小分子抑制剂复合物的晶体 |
| 5.2.4 BRD4-BD2的蛋白纯化及晶体条件的筛选 |
| 5.2.5 Alpha Screen活性平台的建立 |
| 5.2.6 蛋白热迁移验证实验的平台建立 |
| 5.2.7 BRD2的BD1和BD2的质粒的构建以及蛋白的纯化 |
| 5.2.8 通过文献总结BRD2-BD1和BD2以往的结晶条件进行重复 |
| 5.2.9 化学合成 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 Alpha Screen方法的建立 |
| 5.3.2 BET BD2选择性抑制剂BY27(CDJ152)体外活性 |
| 5.3.3 BET BD2选择性抑制剂BY27(CDJ152)的蛋白热迁移验证 |
| 5.3.4 BET BD2选择性抑制剂BY27(CDJ152)的晶体实验 |
| 5.3.5 BRD4 BD2选择性抑制剂ZB-BD-224的晶体研究 |
| 5.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）小麦TaCKX4、TaNAC1基因TILLING突变体的鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词简表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦育种概述 |
| 1.2 细胞分裂素氧化酶研究进展 |
| 1.2.1 细胞分裂素 |
| 1.2.2 细胞分裂素氧化酶 |
| 1.3 TILLING技术研究进展 |
| 1.3.1 TILLING技术的原理与流程 |
| 1.3.2 TILLING技术的特点与优势 |
| 1.4 HRM技术研究进展 |
| 1.4.1 HRM技术的原理 |
| 1.4.2 HRM技术的优势 |
| 1.4.3 HRM技术的应用前景 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 济麦22号TILLING突变系TaCKX4、TaNAC1 突变位点的检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验试剂及溶液配制 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 小麦TILLING突变库中TaCKX4、TaNAC1 基因突变位点的查询 |
| 2.2.2 TILLING突变系DNA的提取及质量检测 |
| 2.2.3 PCR扩增目的条带 |
| 2.2.4 切胶回收目的片段 |
| 2.2.5 PCR扩增产物加A尾 |
| 2.2.6 T载体连接 |
| 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.9 挑菌、菌落PCR、单菌落培养及鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DNA浓度、纯度及质量检测 |
| 2.3.2 PCR引物筛选及扩增结果 |
| 2.3.3 连接转化结果 |
| 2.3.4 TaCKX4、TaNAC1 基因序列比对 |
| 2.4 讨论 |
| 3 TaCKX4、TaNAC1 突变体的生理功能分析和基因表达分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试验试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 种子预处理 |
| 3.2.2 幼苗处理 |
| 3.2.3 根长势测定 |
| 3.2.4 植株高度测定 |
| 3.2.5 叶绿素含量测定 |
| 3.2.6 根细胞活力测定 |
| 3.2.7 叶绿素荧光参数测定 |
| 3.2.8 基因表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 硫酸锌对不同小麦株系幼苗长势的影响 |
| 3.3.2 硫酸锌对不同小麦株系幼苗叶片叶绿素含量的影响 |
| 3.3.3 硫酸锌对不同小麦株系幼苗根细胞活力的影响 |
| 3.3.4 干旱胁迫对不同小麦株系幼苗叶绿素荧光参数的影响 |
| 3.3.5 基因表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 基于HRM技术筛选TaCKX1 突变体的应用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试验试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 基因组DNA提取及检测 |
| 4.2.2 HRM引物设计及筛选 |
| 4.2.3 HRM筛选TaCKX1 突变体 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 结论及主要创新点 |
| 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（4）拟南芥花期调控基因SSF自然变异鉴定与功能解析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词一览表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物花期调控研究进展 |
| 1.1.1 光周期途径调控植物开花 |
| 1.1.2 自主途径调控植物开花 |
| 1.1.3 春化途径调控开花 |
| 1.1.4 赤霉素(GA)途径调控开花 |
| 1.1.5 年龄途径调控开花 |
| 1.1.6 调控开花时间的其他因素 |
| 1.2 自然变异在植物开花时间调控中的作用 |
| 1.2.1 植物中自然变异概述 |
| 1.2.2 GWAS和 QTL在鉴定自然变异中的作用 |
| 1.2.3 自然变异调控植物开花时间 |
| 1.3 泛素化修饰在植物开花时间调控中的作用 |
| 1.4 研究背景与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 GWAS和 QTL分析鉴定参与花期调控功能性自然变异 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂及配方 |
| 2.2.3 实验技术 |
| 2.2.4 实验所用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 GWAS群体表型统计 |
| 2.3.2 GWAS分析 |
| 2.3.3 QTL群体构建及QTL分析 |
| 2.3.4 分子标记分组验证QTL候选区域显着性 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 GWAS鉴定AT2G47310 区域与FLC表达相关 |
| 2.4.2 QTL鉴定AT2G47310 与花期调控和FLC表达相关 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 候选基因的鉴定和表型分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂及配方 |
| 3.2.3 实验技术 |
| 3.2.4 实验所用仪器 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 候选区域开花时间调控基因基因组DNA序列比对 |
| 3.3.2 目的基因克隆和测序 |
| 3.3.3 突变体鉴定 |
| 3.3.4 组织表达模式分析: |
| 3.3.5 SSF-GFP亚细胞定位模式分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 拟南芥花期调控GWAS和 QTL的候选基因鉴定 |
| 3.4.2 候选基因SSF表型鉴定 |
| 3.4.3 候选基因SSF组织表达模式和亚细胞定位分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SSF参与FLC调节的遗传途径和功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂及配方 |
| 4.2.3 分子操作技术 |
| 4.2.4 实验所用仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 光周期处理 |
| 4.3.2 春化处理 |
| 4.3.3 FRIGIDA途径突变体杂交 |
| 4.3.4 自主途径突变体杂交 |
| 4.3.5 Lnc RNA COOLIAIR表达分析 |
| 4.3.6 转录活性及Ch IP分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 SSF调控开花时间不响应光周期和春化处理 |
| 4.4.2 SSF调控FLC表达不依赖FRI和 FCA途径 |
| 4.4.3 SSF调控长链非编码RNA COOLAIR表达 |
| 4.4.4 SSF在转录水平调控FLC基因表达 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 花期调控基因SSF多态性表型和互作分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂及配方 |
| 5.2.3 分子操作技术 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 转基因及表型分析 |
| 5.3.2 质谱分析筛选SSF互作蛋白 |
| 5.3.3 Y2H验证相互作用 |
| 5.3.4 BIFC验证相互作用 |
| 5.3.5 Pull-down验证相互作用 |
| 5.3.6 Co-IP验证相互作用 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 SSF N414D多态性导致开花时间和FLC表达差异 |
| 5.4.2 Pull-down质谱分析鉴定SSF互作蛋白 |
| 5.4.3 开花调控因子SSF多态性影响自身与E3 泛素连接酶CUL1 互作 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 CUL1 参与介导泛素化修饰调控拟南芥花期 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验试剂及配方 |
| 6.2.3 分子操作方法 |
| 6.2.4 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 CUL1 突变体鉴定及表型分析 |
| 6.3.2 原生质体转化检测CUL1调控SSF的泛素化降解 |
| 6.3.3 体外蛋白降解和免疫印迹检测CUL1 降解SSF功能 |
| 6.3.4 定量分析验证CUL1 不影响SSF基因表达 |
| 6.3.5 酵母双杂交实验验证CUL1与FCA互作 |
| 6.3.6 蛋白免疫印迹检测CUL1 泛素化降解FCA |
| 6.3.7 定量分析验证CUL1 不影响FCA基因表达 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 CUL1 功能丧失导致FLC下调和植物早花表型 |
| 6.4.2 CUL1通过与SSF相互作用调控SSF的泛素化降解 |
| 6.4.3 CUL1通过与FCA相互作用调控FCA的泛素化降解 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 花期调控基因SSF的多态性功能和环境适应性分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验试剂及配方 |
| 7.2.3 分子操作方法 |
| 7.2.4 实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 体外蛋白降解检测SSFN414D蛋白稳定性 |
| 7.3.2 MG132 处理检测SSFN414D转基因株系蛋白稳定性 |
| 7.3.3 蛋白印迹验证SSFN414D蛋白稳定性 |
| 7.3.4 定量分析和蛋白免疫印迹检测SSFN414D蛋白水平受泛素化修饰 |
| 7.3.5 SSF多态性与环境适应性分析 |
| 7.3.6 FCA和 SSF的基因家族分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 开花时间调控基因SSFN414D自然变异影响SSF蛋白降解 |
| 7.4.2 SSF多态性与环境适应性分析 |
| 7.4.3 SSF和 FCA基因家族分析 |
| 7.5 讨论 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 GWAS自然群体FLC表达数据 |
| 附录2 QTL F_2群体花期数据 |
| 附录3 课题所用引物 |
| 作者简介 |
（5）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（6）长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析（论文提纲范文）
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）陆地棉GhHDA5和GhHDA6基因在棉花早熟性中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物开花的研究进展 |
| 1.1.1 花形态建成 |
| 1.1.2 开花调控途径 |
| 1.2 棉花早熟相关QTL和基因的研究进展 |
| 1.2.1 棉花早熟相关QTL定位 |
| 1.2.2 棉花早熟相关基因的克隆和功能验证 |
| 1.3 去乙酰化酶的研究进展 |
| 1.3.1 RPD3-type HDACs家族成员结构分析 |
| 1.3.2 RPD3 基因家族在植物生长发育过程中的作用 |
| 1.3.3 RPD3 家族基因在逆境胁迫中的作用 |
| 1.3.4 RPD3 家族基因在棉花中的研究 |
| 1.4 本课题研究意义 |
| 第二章 GhHDA6 基因的克隆和功能分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 群体构建和QTL-mapping |
| 2.1.2 候选基因鉴定 |
| 2.1.3 基因克隆和序列分析 |
| 2.1.4 构建载体 |
| 2.1.5 ProGhHDA6::GUS转基因拟南芥组织表达 |
| 2.1.6 启动子活性检测 |
| 2.1.7 亚细胞定位 |
| 2.1.8 过表达GhHDA6 转基因拟南芥开花表型 |
| 2.1.9 病毒诱导GhHDA6 基因沉默 |
| 2.1.10 自激活检测 |
| 2.1.11 酵母双杂交文库筛选及互作验证 |
| 2.1.12 双分子荧光互补(BiFC) |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 QTL-mapping |
| 2.2.2 候选基因功能注释 |
| 2.2.3 GhHDA6 基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.4 GhHDA6 组织表达模式分析 |
| 2.2.5 启动子作用元件分析 |
| 2.2.6 启动子活性检测 |
| 2.2.7 GhHDA6 基因定位在细胞核 |
| 2.2.8 GhHDA6 过表达促进拟南芥开花 |
| 2.2.9 病毒诱导GhHDA6 基因沉默延迟棉花开花时间 |
| 2.2.10 自激活检测 |
| 2.2.11 筛选AD酵母文库质粒 |
| 2.2.12 GhHDA6 与候选基因在酵母细胞中的互作 |
| 2.2.13 双分子荧光互补 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 利用QTL-seq技术对陆地棉果枝始节位(NFFB)进行QTL定位和候选基因的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 极端表型的鉴定和两个DNA混池的构建 |
| 3.1.3 基因组DNA的提取和Illumina测序 |
| 3.1.4 原始数据过滤和测序质量检查 |
| 3.1.5 突变位点检测和QTL-seq分析 |
| 3.1.6 共定位和候选基因鉴定 |
| 3.1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1.8 GhAPL和 GhHDA5 基因结构及蛋白序列分析 |
| 3.1.9 VIGS试验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 极端表型鉴定和两个混池的构建 |
| 3.2.2 使用Illumina测序进行质量评估 |
| 3.2.3 突变位点检测及QTL-seq分析 |
| 3.2.4 QTL-seq分析和与以往研究的共定位 |
| 3.2.5 通过表达模式分析鉴定候选基因 |
| 3.2.6 GhAPL和 GhHDA5 基因结构及序列分析 |
| 3.2.7 棉花基因GhAPL和 GhHDA5 的沉默 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 棉花RPD3/HDA1 基因家族的全基因组鉴定和表达模式分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 RPD3 家族成员的鉴定和蛋白序列提取 |
| 4.1.3 RPD3 蛋白的多重比对和系统发育分析 |
| 4.1.4 RPD3 基因在染色体上的分布、基因结构和保守基序分析 |
| 4.1.5 基因复制事件和选择压力 |
| 4.1.6 GhRPD3 基因启动子区的顺式元件分析 |
| 4.1.7 基因表达模式分析 |
| 4.1.8 RNA提取及荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RPD3 基因家族在9 个物种中的鉴定 |
| 4.2.2 RPD3 基因家族的系统发育分析 |
| 4.2.3 外显子-内含子结构和保守结构域分析 |
| 4.2.4 染色体分布、基因复制和选择压力 |
| 4.2.5 GhRPD3 基因启动子区域顺式元件的分析 |
| 4.2.6 GhRPD3 基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式分析 |
| 4.2.7 在花芽分化过程中GhRPD3 基因的表达模式分析 |
| 4.2.8 GhRPD3 基因对MeJA和 ABA处理的响应 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 棉花RPD3 基因家族的系统发育、基因结构分析 |
| 4.3.2 陆地棉GhRPD3 基因的功能分析 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）水稻小粒窄叶基因GSNL4的精细定位与基因克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 RNA的分类及RNA沉默 |
| 1.1.1 RNA的分类 |
| 1.1.2 RNA沉默途径 |
| 1.2 AGO蛋白的结构及分类 |
| 1.2.1 AGO蛋白的结构特点 |
| 1.2.2 AGO蛋白的分类 |
| 1.3 植物AGO蛋白对生长发育的调控 |
| 1.3.1 拟南芥AGO蛋白在生长发育中的调控作用 |
| 1.3.2 水稻AGO蛋白在生长发育中的调控作用 |
| 1.3.3 其他植物AGO1蛋白在生长发育中的调控作用 |
| 1.4 叶宽调控基因的分子机理 |
| 1.5 粒形调控基因的分子机理 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.2 常用试剂与仪器 |
| 2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2 常用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 农艺性状调查 |
| 2.3.2 水稻DNA的提取 |
| 2.3.3 水稻总RNA的提取 |
| 2.3.4 水稻miRNA的提取 |
| 2.3.5 总RNA的反转录 |
| 2.3.6 miRNA的反转录 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳及纯化回收 |
| 2.3.8 石蜡切片 |
| 2.3.9 扫描电镜 |
| 2.3.10 生长素含量的测定 |
| 2.3.11 原生质体的制备与转化 |
| 2.3.12 基因定位与克隆 |
| 2.3.13 相关载体的构建 |
| 2.3.14 miRNA测序 |
| 2.3.15 花粉育性分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 gsnl4突变体植株的表型及农艺性状分析 |
| 3.2 gsnl4突变体的石蜡切片和扫描电镜分析 |
| 3.2.1 gsnl4突变体叶片组织学分析 |
| 3.2.2 gsnl4突变体节间组织学分析 |
| 3.2.3 gsnl4突变体颖壳组织学分析 |
| 3.3 GSNL4 的遗传分析与精细定位 |
| 3.3.1 GSNL4 的遗传分析 |
| 3.3.2 GSNL4 基因的精细定位 |
| 3.3.3 候选基因分析 |
| 3.3.4 GSNL4 的突变位点具有保守性 |
| 3.4 GSNL4 的功能验证 |
| 3.5 亚细胞定位及时空表达模式 |
| 3.5.1 GSNL4 的亚细胞定位 |
| 3.5.2 GSNL4 的时空表达模式 |
| 3.6 gsnl4突变体的miRNA测序分析 |
| 3.7 gsnl4突变体中miRNA及其靶基因的表达分析 |
| 3.8 生长素含量的测定及相关基因的表达分析 |
| 3.9 GSNL4的GWAS分析和单倍型分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 水稻穗的结构 |
| 1.3 水稻穗的发育 |
| 1.4 水稻穗发育调控基因的重要研究进展 |
| 1.4.1 水稻穗分生组织活性的调控 |
| 1.4.2 水稻穗枝梗发育的调控 |
| 1.4.3 水稻小穗分化的调控 |
| 1.5 水稻穗退化的调控机理研究现状 |
| 1.6 植物果胶物质的合成代谢研究进展 |
| 1.6.1 果胶的功能和种类 |
| 1.6.2 果胶的合成 |
| 1.6.3 果胶的代谢 |
| 1.7 水稻基因定位技术的现状 |
| 1.7.1 水稻突变体库的创制 |
| 1.7.2 Mutmap技术定位基因 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水稻叶片小样DNA的抽提及PCR阳性检测 |
| 2.2.2 突变家系的表型与T-DNA插入的共分离分析 |
| 2.2.3 水稻各组织总RNA抽提及浓度测定 |
| 2.2.4 反转录和定量PCR |
| 2.2.5 载体的构建及遗传转化方法 |
| 2.2.6 水稻幼穗扫描电镜样品制备及电镜观察 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 免疫组化检测水稻果胶含量 |
| 2.2.9 Mutmap群体构建 |
| 2.2.10 SDS法水稻DNA大样小抽 |
| 2.2.11 稀穗突变体基因型鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RBH1 基因的克隆和功能分析 |
| 3.1.1 rbh1-1 突变表型的鉴定 |
| 3.1.2 rbh1-1 突变体T-DNA阳性检测 |
| 3.1.3 rbh1-1 突变体穗退化表型与T-DNA元件的共分离检测 |
| 3.1.4 rbh1-1 等位突变体的鉴定 |
| 3.1.5 rbh1-1 突变体的功能互补实验 |
| 3.1.6 rbh1-1 突变体的穗发育表型观察 |
| 3.1.7 rbh1-1 突变体顶端穗透射电镜观察 |
| 3.1.8 RBH1 基因表达模式分析 |
| 3.1.9 RBH1 基因超量表达 |
| 3.1.10 RBH1 蛋白序列分析 |
| 3.1.11 RBH1 蛋白表达及酶活验证 |
| 3.1.12 rbh1-1 突变体内果胶含量检测 |
| 3.1.13 RBH1 基因突变引起ROS水平的变化 |
| 3.1.14 ROS介导的细胞分化活性 |
| 3.2 水稻穗突变体的鉴定 |
| 3.2.1 穗突变体的鉴定 |
| 3.2.2 穗突变体自交F2 群体的构建及基因组大样抽提 |
| 3.2.3 A437 突变体的基因定位 |
| 3.2.4 A564 突变体的基因定位 |
| 3.2.5 C265 稀穗材料的基因定位 |
| 3.2.6 F13 稀穗材料的基因定位 |
| 3.2.7 F13 穗突变体的农艺性状考察 |
| 3.2.8 F13 穗突变体候选基因的功能分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RBH1 突变导致明显的顶端穗缺陷 |
| 4.2 RBH1 编码参与果胶降解的果胶裂解酶 |
| 4.3 ROS积累水平的变化对于植物发育的调控 |
| 4.4 ROS可能与激素协同调控穗发育 |
| 4.5 Mutmap技术进行基因定位的优势与不足 |
| 4.6 基于EMS诱变的Mutmap在生产育种中的潜在应用价值 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
（10）结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 直播稻的特点及发展现状 |
| 1.2 水稻直播出苗的动力源分析 |
| 1.3 水稻中胚轴伸长 |
| 1.3.1 影响中胚轴伸长的环境因素 |
| 1.3.2 植物激素对中胚轴伸长的调控 |
| 1.3.3 水稻中胚轴伸长机制 |
| 1.4 QTL定位 |
| 1.4.1 QTL定位原理 |
| 1.4.2 QTL定位的分子标记 |
| 1.4.3 已定位的水稻中胚轴伸长QTL |
| 1.4.4 已发掘的中胚轴伸长相关基因 |
| 1.5 QTL-seq用于作物QTL定位 |
| 1.6 KASP高通量分型技术 |
| 1.7 研究目的与技术路线 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.2.1 常用分子生物学试剂盒 |
| 2.2.2 常用生化试剂 |
| 2.2.3 CTAB缓冲液的配制 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 幼苗培养与中胚轴长度测定 |
| 2.3.2 DNA提取 |
| 2.3.3 混池测序和参考基因组比对分析 |
| 2.3.4 SNP检测与注释 |
| 2.3.5 KASP标记检测 |
| 2.3.6 遗传图谱构建及QTL鉴定 |
| 2.3.7 InDel标记开发与鉴定 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.3.9 水稻幼苗中胚轴组织的总RNA提取 |
| 2.3.10 反转录及实时荧光定量PCR |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 亲本中胚轴长度比较 |
| 3.2 表型测定 |
| 3.3 混池测序 |
| 3.3.1 测序数据统计 |
| 3.3.2 候选区间的确定 |
| 3.4 遗传连锁图谱构建及QTL分析 |
| 3.5 候选基因注释及表达量分析 |
| 3.6 InDel标记的开发 |
| 3.7 InDel标记在亲本和自然材料中的鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻中胚轴伸长QTL定位 |
| 4.2 水稻中胚轴伸长相关候选基因的发掘 |
| 4.3 水稻中胚轴长度InDel标记的开发 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Determining Cotton Fiber Gene Function via Structuring of Mutant Populations for High-Throughput Reverse Genetics（论文参考文献）
- [1]油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘[D]. 王昊一. 浙江大学, 2021
- [2]靶向调控相关转录蛋白的先导化合物的发现及作用机制研究[D]. 鹿田. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]小麦TaCKX4、TaNAC1基因TILLING突变体的鉴定与功能分析[D]. 郭丁预. 烟台大学, 2021(09)
- [4]拟南芥花期调控基因SSF自然变异鉴定与功能解析[D]. 王云鹤. 安徽农业大学, 2021(01)
- [5]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021
- [6]长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析[D]. 张飞. 安徽农业大学, 2021
- [7]陆地棉GhHDA5和GhHDA6基因在棉花早熟性中的功能分析[D]. 张晶晶. 中国农业科学院, 2021(01)
- [8]水稻小粒窄叶基因GSNL4的精细定位与基因克隆[D]. 宋梦秋. 中国农业科学院, 2021(09)
- [9]影响水稻穗退化基因RBH1的克隆与功能分析及穗发育基因的定位[D]. 何冬. 华中农业大学, 2021
- [10]结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL[D]. 刘畅. 中国农业科学院, 2021(09)