一、抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究（论文文献综述）
王珵珵[1]（2020）在《针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体》文中提出丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是一种小型的单股正链带包膜的RNA病毒,系黄病毒科,丙型肝炎病毒属。目前已经鉴定出八种基因型和八十六个亚型。丙型肝炎病毒感染引发不同程度的肝炎,从轻症肝炎,到肝硬化,甚至肝癌。丙型病毒肝炎危机全球3.5亿多人的生活质量,大约40%到95%的丙肝病毒感染者会发展为慢性丙肝病毒感染,即血液中持续存在丙肝病毒RNA。慢性丙肝病毒感染因此成为一个全球性的健康问题。在2016年,世界卫生组织制定全球抗肝炎策略,目标在2030年消除病毒性肝炎对人类健康的威胁。随着对丙肝病毒的结构及其生活周期的深入了解,最新研发的一种多基因型直接抗病毒药物（direct acting antivirals,DAA）的临床应用彻底改变了传统的丙肝治疗。这种靶向HCV编码蛋白的DAA疗法能够治愈90%以上的感染患者,其中包括HCV感染的晚期肝病患者。但是随着病毒耐药性的形成,治疗失败也常有发生。而目前仍存在的困难包括:在低收入国家能获得诊断的人数少,治疗成本高以及没有抗HCV疫苗的问题。因此,研制预防性疫苗是控制全球丙肝病毒感染的必要手段。HCV的E1和E2包膜糖蛋白会在病毒表面形成异质二聚体,通过与宿主细胞受体结合介导病毒的进入。在过去的几十年内,人们在体外表达的E1E2异质二聚体往往质量不高,因而难以对其结构和功能进行研究。基于对HCV包膜糖蛋白的部分已知结构及对比其他黄病毒包膜蛋白特点,推测E2蛋白是经典的融合蛋白,而E1可能是参与融合的蛋白。E2包膜糖蛋白的胞外域是呈球形的非延伸的折叠,并分为不同的两层:包括有前层结构域及中央免疫球蛋白折叠结构域的前层,和后层（Back layer,BL）。有研究发现E1和可溶性E2糖蛋白的后层结构域（soluble E2-Back layer domain,sE2-BLd）之间存在关键相互作用,而sE2-BLd与E1相互作用正参与HCV包膜与细胞膜融合发生显着构象变化的过程中。我们实验室前期实验结果发现HCV包膜糖蛋白sE2-BLd以可溶形式,在HCV进入宿主细胞过程中发挥抑制作用。为研究E2-BLd多肽是否可以作为免疫原引发机体产生中和HCV的免疫反应,我们构建了用于表达E2,E2-BLd的质粒。为优化E2-BLd的表达,我们还对其中未配对的半胱氨酸进行了突变,避免蛋白聚集的形成。将构建的这些质粒转染哺乳动物细胞中表达带有组氨酸标签（histidine-tag,his-tag）的蛋白,发现这些组氨酸标签蛋白难以纯化。因此,为提升蛋白产量,我们构建了带谷胱甘肽巯基转移酶标签（glutathione S-transferase tag,GST-tag）的质粒,用于在大肠杆菌DE3菌株（Escherichia coli DE3/BL21,E.coli DE3/BL21）中表达可溶性重组蛋白,其蛋白产量足够用于建立酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。之后,我们决定采取直接将质粒电脉冲到小鼠肌肉中表达E2和E2-BLd,这种DNA免疫方法同时具备操作方便和免疫原纯度高的优势。细胞培养扩增的HCV病毒（Cell-culture grown HCV,HCVcc）可用于研究病毒复制过程中吸附和入侵阶段的机制。为了评估E2-BLd抗体对病毒感染的潜在保护效果,我们分离免疫小鼠血清并检测其对HCVcc病毒的中和能力。但未检测到E2和E2-BLd免疫的小鼠产生了具有中和病毒效力的特异性免疫应答。然而,我们采用蛋白免疫印迹实验（Western Blotting,WB）和酶联免疫吸附实验却能检测到小鼠血清中存在能够识别来自HCV病毒H77毒株和J6毒株抗原的特异性抗体。综上所述,我们通过DNA免疫小鼠的方法获得了抗HCV核心蛋白,E2和E2-BLd（来源HCV H77毒株）的多克隆抗体,证实我们的免疫方法有效。为后续研究E2-BLd抗体抑制HCV进入宿主细胞奠定了生物学基础。
张坤[2]（2017）在《大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析》文中研究说明病毒的基因组相对较小,蛋白编码能力有限,而病毒的侵染、复制、移动、致病等过程均需要一种或者几种病毒蛋白的直接参与。在寄主与病毒长期地共进化过程中,病毒蛋白逐渐进化出同时具有多种功能的特性,并参与病毒侵染循环的不同过程。大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）是一种ss（+）RNA病毒,基因组由α、β和γ3条RNA链组成。RNAα编码的αa蛋白具有解旋酶（HEL）和甲基转移酶（MET）结构域,是病毒的复制酶大亚基;RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和病毒的运动相关蛋白TGBs,RNAy编码的γa具有保守的GDD基序,是病毒的复制酶小亚基。γb是一个分子量为17 kDa的富含半胱氨酸的蛋白,具有致病决定因子、种传相关因子、本生烟上的系统运动决定因子和基因沉默抑制子等多种功能,但其与BSMV其它蛋白间的相互作用并协同调控病毒的复制和运动的研究尚未见报道。前人的研究表明,在BSMV侵染的条件下γb蛋白主要定位于细胞质中,部份能特异性的定位于叶绿体上,但是关于其叶绿体定位的生物学功能却是未知的。为此,利用瞬时表达、Pumilio为基础的ssRNA可视化定位系统、dsRNA可视化定位系统等,在激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察到病毒的复制酶αa和γa、病毒的（+）RNA、复制过程中产生的（-）RNA及dsRNA复制中间体均能定位于叶绿体,通过实验证据明确了叶绿体是BSMV的主要复制位点。通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等技术,首次证明γb蛋白与复制酶αa在体内直接互作,yb被αa招募至病毒的复制位点,互作的关键区域分别为yb蛋白的coiled-coil区（aa 86-127）和复制酶αa的甲基转移酶结构域（aa 1-834）。通过分析γb蛋白缺失或者突变后病毒的复制积累量,以及顺式或反式表达番茄丛矮病毒（TBSV）抑制子p19均不能回补由于γb蛋白的缺失或者突变造成的BSMV复制缺陷等实验,首次发现γb蛋白具有促进病毒复制的新功能,且该功能与其基因沉默抑制子的活性关系不大;通过体外dsRNA解旋酶活性等实验证明γb蛋白促进复制酶αa的解旋酶活性,且该促进作用完全依赖于其ssRNA结合活性。γb蛋白通过与复制酶αa直接互作被招募至BSMV主要复制场所叶绿体、以及作为解旋酶增强子促进病毒复制这些新功能的发现增加了我们对病毒编码的基因沉默抑制子多功能性的进一步认识。作为在本生烟上的系统运动决定因子,γb蛋白参与BSMV运动的具体形式及其调控机制并不清楚。通过分析缺失γb蛋白的BSMV突变体在本生烟和大麦上的运动效率及其致病性,证明了BSMV在不同的寄主植物的运动中对于γb蛋白的需求是不同的,即双子叶植物本生烟需要γb参与,而单子叶植物大麦上却不需要,这可能与植物的维管束组织存在差异有关;利用Y2H及BiFC证明了 γb蛋白与病毒的运动蛋白TGB2发生互作;Co-IP实验证明了 γb蛋白是病毒核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）运动复合物的组分;最后,通过CLSM观察发现,缺失γb蛋白的病毒突变体在本生烟上表现出胞间运动受阻的现象。这些实验初步证明了 γb蛋白能与运动蛋白TGB2于微丝或内质网上互作,并可能作为病毒RNP运动复合物的组分来促进BSMV的胞间运动。γb蛋白促进BSMV复制和运动新功能的发现有助于我们深刻理解病毒编码的基因沉默抑制子和富含半胱氨酸的小病毒蛋白的多功能性。
成军[3]（2004）在《功能基因组学与肝脏疾病研究》文中研究指明功能基因组学是指应用整体的研究技术阐明基因和蛋白的生物学功能.因此,需要发展一些强大的分析技术,对基因和蛋白质的功能进行研究.这必将为肝脏病学的研究提供了一个前所未有的发展机遇.本文主要论述功能基因组学的先进技术在肝病领域的应用.
钟彦伟,成军,焦成松,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[4]（2004）在《抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究》文中研究指明目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 （ELISA）和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。
钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[5]（2004）在《丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达》文中研究指明目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 （HCV）核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 （抗 Id）scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 （IPTG）诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 （ELISA）证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。
徐进平[6]（2003）在《HCV E1和HCMV IE86蛋白的性质和功能研究》文中提出本文包括两个部分：（1）人丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）E1基因的表达及E1蛋白质免疫学性质研究。（2）人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）最早期蛋白与转录调控蛋白相互作用研究。 本文首次报道了HCV武汉株（WH strain）全长E1基因cDNA全序列，将该cDNA分别克隆于载体pQE30、pBlueBacHisB和pcDNA3.1（-）中，分别在大肠杆菌、真核细胞和实验动物肌肉组织中进行表达。全面研究了HCV E1 cDNA在大肠杆菌和真核细胞中表达的HCV E1蛋白的抗原性和免疫原性。该研究有助于进一步了解HCV包膜蛋白的功能和揭示HCV E1的变异规律及其特点，为将E1蛋白质应用于HCV的临床诊断和研制有效的、HCV疫苗，预防和治疗丙型肝炎提供了重要的参考和依据。 HCV全长E1 cDNA含576bp，编码含192个氨基酸的蛋白质。HCV武汉株和日本株（HCV-J型）E1基因核苷酸的同源性为74.48％，编码的氨基酸的同源性为78.13％。其免疫优势表位P1（210-223aa）和P2（315-327aa）氨基酸序列同源性分别为71.43％和100％。这证实了Ray以前所推测的P1可能是一个变异较大的区域，而P2较保守的观点。 大肠杆菌中表达的HCV E1为23kDa、非糖基化的融合蛋白，形成包涵体。以包涵体作为抗原，采用ELISA可检测出HCV阳性患者血清中的抗体，在确定的HCV阳性患者中阳性检出率为48/90。推测E1的抗原性可能与其B细胞表位，即RMAWDMMMNW（317-326aa）相关，而与E1蛋白是否糖基化无关。以包涵体作为免疫原，小鼠抗HCV E1 IgG抗体水平在第8周达到高峰，抗体滴度可达1：2400；家兔抗HCV E1IgG抗体水平在第8周达到高峰，抗体滴度可达1：5760，并能诱导小鼠粘膜产生免疫应答。E1蛋白能诱生小鼠较高水平的CTL应答、DTH应答，并引起CD8- T细胞数量在免疫后明显升高。推测E1蛋白表达所形成的包涵体结构直接作为免疫原，有利于HCV E1抗原的呈递。说明HCV E1包涵体蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。 HCV E1基因cDNA在昆虫细胞中的表达产物主要为40kDa的融合蛋白，极弱地表达29-40kDa蛋白。推测该蛋白分子量差异是因表达产物经不同程度糖基化所致。以40kDa E1蛋白为抗原，采用ELISA方法检测HCV抗体，在确定的HCV阳性患者中阳性检出率48/90。该检测结果与包涵体HCV E1蛋白临床检测一致，但反应强弱有差异，糖基化蛋白反应弱。该蛋白可诱生免疫实验动物产生特异性体液免疫应答。小鼠抗HCV E1 IgG抗体水平在第6周达到高峰，抗体滴度可达1：2400；家兔抗HCV E1华中农业大学博士学位论文工gG抗体水平在第8周达到高峰，抗体滴度可达1:7680。HCvEI糖基化蛋白能诱生小鼠抗s工gG反应，但不能诱生小鼠slgA反应。通过LDH检测，发现该蛋白也能诱生小鼠CTL应答，并引起小鼠免疫后CD扩T细胞数量明显升高以及DTH应答，说明HCV El糖基化蛋白能诱生细胞免疫应答。 采用脂质体转染技术，用pcEI转染肝癌细胞HepGZ，HCvEI基因cDNA在HepGZ细胞中表达，表达产物为35kDa的单一糖基化成熟蛋白，且该蛋白能与临床HCV抗体阳性血清特异结合。采用亲和免疫细胞组织化学技术证实小鼠股四头肌细胞能摄取质粒pcEI DNA，并表达了HcvEI蛋白。通过肌肉注射途径，直接注射裸露质粒pcEI DNA免疫实验动物，发现pcEI DNA能引起7/8小鼠，5/5家兔抗HCVEI抗体阳转，诱导机体产生特异性抗HCv El抗体。通过LDH检测和比较CD;+/CD，‘比例，peEI引起小鼠免疫后CDs+T细胞数量明显升高以及DTH应答，说明pcEI能诱生小鼠特异性细胞免疫应答。 以人巨细胞病毒的最早期蛋白工E86为材料，研究工E86蛋白与细胞和其它病毒的转录调控因子和通用转录因子相互作用形成复合物的能力，建立基因表达调控的大分子体系研究模型。为在大分子体系水平上，进一步了解大分子体系中蛋白质的相互作用方式，以及这些相互作用对基因表达调控的具体意义奠定了基础。 将HCMV IE86 eDNA克隆入pGEX一 ZT表达载体，在大肠杆菌中表达出GST一IE86融合蛋白。SDS一PAGE和Western blot分析表明，GST一IE86融合蛋白存在于细胞裂解上清中，为可溶性蛋白，分子量为92kDa。通过亲和层析柱纯化，分别获得纯化的GST和GST一IE86融合蛋白。采用特异性亲和层析共分离技术研究HCMV IE86蛋白与转录调控因子和通用转录因子的相互作用。表明HCMV工E86蛋白能与直接结合启动子DNA的转录调控因子SPI、API、APZ及通用转录因子TFllB相互作用而形成异源蛋白复合物，该转录调控因子及通用转录因子与HCMV工E86蛋白同时被吸留在亲和层析柱中。但是，HCMV工E86蛋白不能与NF一KB相互作用。 HCMV IE86蛋白与转录调控因子及通用转录因子相互作用的活性与IE86蛋白的糖基化无关，而IE86蛋白的锌指结构可能是关键。IE86通过与SPI、API、APZ等转录调控因子、RNA多聚酶H所用的通用转录因子TFllD、TFllB等相互作用形成大分子体系，通过这种大分子体系的作用启动和增强转录。工E86蛋白在识别和结合启动子特异序列的转录调控因子与RNA多聚酶H的通用转录因子如TFllD、TFllB之间可能起到连系的桥梁作用，从而加速转录起始复合物的装配过程。我们推测工E86?
成军[7]（2003）在《病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略》文中提出乙型肝炎病毒 （HBV）和丙型肝炎病毒 （HCV）感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显着影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 （HCC）发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。
钟彦伟,成军,焦成松,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[8]（2003）在《抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A单链抗体的制备及免疫组织化学研究》文中认为目的:研制抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源噬菌体单链可变区抗体,并探讨其在临床病理学诊断中的应用价值。方法:以大肠杆菌表达的重组HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,利用抗原-抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）和DNA序列分析,获得HCV NS5A的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV NS5A抗原进行免疫组化鉴定。结果:ELISA结果表明,制备的HCV NS5A人源单链抗体能与HCV NS5A抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV NS5A抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论:此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,为HCV NS5A病原的检测提供了新的有效的检测手段。
牟劲松,刘妍,王刚,成军,段惠娟,李克,陆荫英,王琳,王惠芬[9]（2003）在《应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因》文中进行了进一步梳理目的:应用抑制性消减杂交技术（SSH）构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1（-）-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1（-）为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。
成军,李克,陆荫英,王琳,刘妍[10]（2003）在《丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析》文中提出目的:克隆丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析。方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为“诱饵（bait）”,筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因。应用生物信息学（bioinformatics）技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6（HCBP6）全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析。获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列。对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息。同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列。通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点。通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测。结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成。人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构。通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上。在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点。利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列。对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能。利用在线软件,对人的 HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息。这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助。结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景。
二、抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究（论文提纲范文）
（1）针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文部分 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的发现 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的病原学 |
| 1.2.1 丙型肝炎病毒基因组及病毒蛋白 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒颗粒的结构 |
| 1.2.3 丙型肝炎病毒生命周期 |
| 1.3 丙型肝炎病毒研究中面临的主要困难 |
| 1.4 丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域 |
| 1.5 项目概况 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.1.1 质粒及引物的设计与合成 |
| 2.1.2 构建质粒方法 |
| 2.1.3 质粒扩增 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.2.1 细胞株及细胞培养基 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.2.5 构建稳转细胞株 |
| 2.3 蛋白表达与纯化 |
| 2.3.1 细胞转染 |
| 2.3.2 细胞裂解 |
| 2.3.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.4 抗体 |
| 2.3.5 考马斯亮蓝染色及丽春红染色 |
| 2.3.6 蛋白表达 |
| 2.3.7 蛋白纯化 |
| 2.4 小鼠免疫 |
| 2.4.1 小鼠 |
| 2.4.2 质粒DNA免疫 |
| 2.4.3 丙型肝炎病毒假病毒颗粒包装 |
| 2.4.4 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 2.4.5 病毒滴度的测定 |
| 2.4.6 中和实验 |
| 2.4.7 酶联免疫吸附实验 |
| 2.4.8 免疫血清对病毒抗原的识别 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 哺乳动物细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.1.1 真核表达载体的构建 |
| 3.1.2 构建表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的稳转细胞株 |
| 3.1.3 丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的表达与纯化 |
| 3.2 原核细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 优化原核表达条件 |
| 3.2.3 原核表达蛋白的制备与纯化 |
| 3.3 制备丙型肝炎病毒 |
| 3.3.1 丙型肝炎病毒假病毒颗粒的包装 |
| 3.3.2 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 3.4 小鼠免疫实验 |
| 3.4.1 小鼠免疫程序 |
| 3.4.2 免疫小鼠血清中和感染性丙型肝炎病毒颗粒 |
| 3.4.3 酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清中特异性抗体 |
| 3.4.4 免疫小鼠血清抗体识别病毒抗原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 英文部分 |
| Abstract |
| Chapter1 Introduction |
| 1.1 Discovery of Hepatitis C Virus |
| 1.2 Etiology of Hepatitis C Virus |
| 1.2.1 HCV genomes and viral proteins |
| 1.2.2 Structure of the hepatitis C virus particle |
| 1.2.3 HCV life cycle |
| 1.3 Major Difficulties in HCV Research |
| 1.4 HCV Glycoproteins E2 Back Layer Domain |
| 1.5 Project Overview |
| Chapter2 Materials and Methods |
| 2.1 Plasmids Construction |
| 2.1.1 Constructs analysis and gene synthesize |
| 2.1.2 Plasmids construction |
| 2.1.3 Constructs amplification |
| 2.2 Cell culture |
| 2.2.1 Cell lines and cell culture medium |
| 2.2.2 Cell passage |
| 2.2.3 Cell cryopreservation |
| 2.2.4 Cell thawing |
| 2.2.5 Stable cell line generation |
| 2.3 Protein expression and purification |
| 2.3.1 Transfection |
| 2.3.2 Cell lysis |
| 2.3.3 Western blotting |
| 2.3.4 Antibodies |
| 2.3.5 Coomassie blue staining |
| 2.3.6 Protein expression |
| 2.3.7 Protein purification |
| 2.4 Mouse immunization |
| 2.4.1 Mice |
| 2.4.2 Plasmid DNA immunization |
| 2.4.3 HCV pseudoparticles packaging and infection |
| 2.4.4 Preparation of cell-culture grown HCV replication |
| 2.4.5 Viral Titration |
| 2.4.6 Neutralization test |
| 2.4.7 Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 2.4.8 Recognition of viral antigens by immune serum |
| Chapter3 Results |
| 3.1 Mammalian cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.1.1 Construction of eukaryotic expression plasmids |
| 3.1.2 Generating stable cell lines that expressing hepatitis Cvirus glycoproteins |
| 3.1.3 Expression and purification of E2- BLd |
| 3.2 Prokaryotic cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.2.1 Construction of prokaryotic expression plasmids |
| 3.2.2 Optimizing prokaryotic expression condition |
| 3.2.3 Preparation and purification of prokaryotic expressed proteins |
| 3.3 Preparation of hepatitis C virus |
| 3.3.1 Hepatitis C virus pseudo particles packaging |
| 3.3.2 Cell culture grown hepatitis C virus preparation |
| 3.4 In vivo expression approach using DNA mouse immunization |
| 3.4.1 Mice immunization strategies |
| 3.4.2 Neutralization ability of the immunized mice sera towards HCVcc |
| 3.4.3 Validate the specific antibodies in mice sera by ELISA |
| 3.4.4 Immunized mice sera recognize viral antigen |
| Chapter4 Discussion |
| Chapter5 Conclusion and prospect |
| References |
| Appendix |
| Acknowledgement |
| About the author |
（2）大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 病毒编码蛋白的相互作用及其多功能性 |
| 1.2 正义单链RNA病毒的复制及其调控 |
| 1.3 大麦条纹花叶病毒的研究概述 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 多功能蛋白γb在BSMV复制中的新功能解析 |
| 3.1 叶绿体是BSMV的主要复制场所 |
| 3.2 γb蛋白能定位于BSMV的复制场所 |
| 3.3 γb蛋白与BSMV的复制酶αa直接互作 |
| 3.4 γb与αa蛋白互作的关键区域 |
| 3.5 γb蛋白的抑制子功能对BSMV复制的影响有限 |
| 3.6 γb蛋白显着的影响BSMV RNAα的复制水平 |
| 3.7 γb蛋白通过直接增强αa解旋酶活性来促进BSMV的复制 |
| 3.8 γb蛋白促进BSMV复制的工作模型 |
| 3.9 小结与讨论 |
| 第四章多功能蛋白γb在BSMV运动中的新功能解析 |
| 4.1 γb蛋白对于BSMV在本生烟上的系统运动是必需的 |
| 4.2 γb蛋白对于BSMV在大麦上的系统运动不是必需的 |
| 4.3 γb蛋白与TGB2蛋白直接互作 |
| 4.4 γb蛋白是BSMV的RNP复合物的组分 |
| 4.5 γb蛋白与TGB2蛋白互作区的确定 |
| 4.6 γb蛋白的突变能减弱病毒的胞间运动 |
| 4.7 γb蛋白组成的RNP运动复合物可能沿着微丝结构运动 |
| 4.8 γb蛋白促进BSMV运动可能的工作模型 |
| 4.9 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ BSMV RNAβ及RNAγ-gfp转基因本生烟的培育 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物与质粒列表 |
| 个人简历 |
（3）功能基因组学与肝脏疾病研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 功能基因组学的定义和内涵 |
| 2 启动子DNA结合蛋白的研究 |
| 3 蛋白与蛋白分子之间的结合 |
| 4 差异显示研究技术 |
| 5 功能缺失表型分析策略 |
| 6 生物信息学技术 |
（4）抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 HCV |
| 1.2 特异性HCV |
| 1.3 肝细胞免疫化学鉴定 |
| 2 结 果 |
| 2.1 具有免疫活性的噬菌体抗体的筛选与鉴定 |
| 2.2 阳性克隆株酶切及DNA序列测定 |
| 2.3 免疫组化结果鉴定 |
| 3 讨 论 |
（6）HCV E1和HCMV IE86蛋白的性质和功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一部分 人丙型肝炎病毒E1基因的表达及E1蛋白质免疫学性质研究 |
| Ⅰ 文献综述 |
| 1.1 人丙型肝炎病毒颗粒的特征 |
| 1.1.1 病毒颗粒的形态 |
| 1.1.2 病毒颗粒的密度 |
| 1.1.3 体外感染细胞内病毒颗粒 |
| 1.2 人丙型肝炎病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 HCV基因组结构及序列的多样性 |
| 1.2.2 HCV蛋白质的加工及病毒蛋白的性质和功能 |
| 1.3 HCV的变异和分型 |
| 1.3.1 HCV的变异 |
| 1.3.2 HCV基因型 |
| 1.3.3 HCV基因型分布 |
| 1.3.4 其它 |
| 1.4 人丙型肝炎病毒的致病性 |
| 1.4.1 急性感染 |
| 1.4.2 慢性感染 |
| 1.4.3 HCV与肝细胞癌 |
| 1.5 HCV的流行病学和临床诊断 |
| 1.5.1 HCV的流行病学 |
| 1.5.2 HCV的临床诊断 |
| 1.6 人丙型肝炎病毒的疫苗 |
| 1.6.1 HCV感染后的免疫应答 |
| 1.6.2 HCV疫苗 |
| 1.7 HCV包膜蛋白的研究进展 |
| 1.7.1 包膜蛋白区的基因结构 |
| 1.7.2 包膜蛋白区高变区 |
| 1.7.3 包膜蛋白的表达 |
| 1.7.4 包膜蛋白的结构和功能 |
| 1.7.5 包膜蛋白的免疫与疫苗研究进展 |
| Ⅱ 研究目的 |
| Ⅲ HCV E1基因的克隆和序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 HCV E1基因的PCR扩增 |
| 3.2.2 HCV E1基因的克隆和鉴定 |
| 3.2.3 含HCV E1基因表达质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.4 HCV E1基因序列测定和分析 |
| 3.2.5 武汉株(WH strain)和日本株(HCV-J型)E1基因DNA和编码氨基酸序列比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HCV E1基因在HCV分型中的作用 |
| 3.3.2 HCV E1蛋白半胱氨酸残基与E1E2复合体 |
| 3.3.3 HCV E1蛋白糖基化位点 |
| 3.3.4 HCV E1蛋白抗原表位结构位点分析 |
| 3.4 小结 |
| Ⅳ HCV E1基因在大肠杆菌中的表达及E1蛋白质免疫学性质的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HCV E1基因在大肠杆菌中的表达 |
| 4.2.2 HCV E1蛋白的纯化 |
| 4.2.3 HCV E1包涵体的电镜观察 |
| 4.2.4 HCV E1蛋白的抗原性分析 |
| 4.2.5 小鼠抗HCV E1 IgG的检测 |
| 4.2.6 家兔抗HCV E1 IgG的检测 |
| 4.2.7 小鼠抗HCV E1 IgA的检测 |
| 4.2.8 小鼠抗HCV E1 SIgG的检测 |
| 4.2.9 小鼠抗HCV E1 sIgA的检测 |
| 4.2.10 CTL效应的检测 |
| 4.2.11 小鼠CD_4~-、CD_8~-细胞数量的变化 |
| 4.2.12 迟发型超敏反应(DTH)结果 |
| 4.2.13 安全性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 HCV E1蛋白抗原性 |
| 4.3.2 HCV E1蛋白诱生特异性体液免疫应答 |
| 4.3.3 HCV E1蛋白诱导小鼠粘膜产生免疫应答 |
| 4.3.4 HCV E1蛋白诱生特异性细胞免疫应答 |
| 4.3.5 HCV E1基因在大肠杆菌中的表达和包涵体蛋白的形成 |
| 4.3.6 HCV E1蛋白糖基化及其免疫学性质的关系 |
| 4.4 小结 |
| Ⅴ HCV E1在昆虫细胞中的表达及E1蛋白质免疫学性质的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组转移质粒的构建 |
| 5.2.2 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 5.2.3 HCV E1基因在昆虫细胞中的表达 |
| 5.2.4 HCV E1蛋白的纯化 |
| 5.2.5 HCV E1蛋白的抗原性分析 |
| 5.2.6 昆虫细胞和大肠杆菌表达的HCV E1蛋白抗原性比较 |
| 5.2.7 小鼠抗HCV E1 IgG的检测 |
| 5.2.8 家兔抗HCV E1 IgG的检测 |
| 5.2.9 小鼠抗HCV E1 IgA的检测 |
| 5.2.10 小鼠抗HCV E1 sIgG的检测 |
| 5.2.11 小鼠抗HCV E1 sIgA的检测 |
| 5.2.12 CTL效应的检测 |
| 5.2.13 小鼠CD_4~-、CD_8~-细胞数量的变化 |
| 5.2.14 迟发型超敏反应(DTH)结果 |
| 5.2.15 安全性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HCV E1基因在昆虫细胞中的表达 |
| 5.3.2 HCV E1蛋白的纯化 |
| 5.3.3 HCV E1蛋白的抗原性 |
| 5.3.4 HCV E1蛋白诱生特异性体液免疫应答 |
| 5.3.5 HCV E1蛋白诱导小鼠粘膜产生免疫应答 |
| 5.3.6 HCV E1蛋白诱生特异性细胞免疫应答 |
| 5.4 小结 |
| Ⅵ HCV E1基因在真核细胞中的表达和DNA免疫 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 含HCV E1基因真核表达质粒的构建和鉴定 |
| 6.2.2 HCV E1基因在真核细胞中的表达 |
| 6.2.3 HCV E1基因在小鼠肌肉组织中的原位表达 |
| 6.2.4 小鼠抗HCV E1 IgG的检测 |
| 6.2.5 兔抗HCV E1 IgG的检测 |
| 6.2.6 体外CTL检测 |
| 6.2.7 CD_4~-、CD_8~-细胞数量的变化 |
| 6.2.8 安全性 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 HCV DNA免疫 |
| 6.3.2 HCV E1基因在HepG2细胞中的表达 |
| 6.3.3 HCV E1基因在肌肉组织中的原位表达 |
| 6.3.4 pcE1诱生的特异性体液免疫应答 |
| 6.3.5 pcE1诱生的特异性细胞免疫应答 |
| 6.3.6 提高HCV DNA免疫效果的途径 |
| 6.3.7 HCV DNA疫苗的安全性 |
| 6.4 小结 |
| Ⅶ 总结 |
| 第二部分 人巨细胞病毒最早期蛋白与转录调控蛋白相互作用研究 |
| Ⅰ 文献综述 |
| 1.1 人巨细胞病毒的致病性 |
| 1.2 人巨细胞病毒颗粒的特征 |
| 1.3 人巨细胞病毒基因组结构 |
| 1.4 人巨细胞病毒基因表达产物 |
| 1.4.1 HCMV的结构蛋白 |
| 1.4.2 HCMV的非结构蛋白 |
| 1.5 人巨细胞病毒立即早期基因 |
| 1.5.1 HCMV基因的时序性表达 |
| 1.5.2 HCMV IE基因的增强子 |
| 1.6 人巨细胞病毒立即早期蛋白功能 |
| 1.6.1 IE72蛋白的功能 |
| 1.6.2 IE86蛋白的功能 |
| 1.6.3 IE55蛋白的功能 |
| Ⅱ 研究目的 |
| Ⅲ 含HCMV IE86 cDNA重组质粒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组质粒pBIE86的构建和鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒pGIE86的构建和鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HCMV IE86基因 |
| 3.3.2 重组质粒pBIE86 |
| 3.3.3 重组质粒pGIE86 |
| 3.4 小结 |
| Ⅳ HCMV IE86基因在大肠杆菌中的表达及GST-IE86融合蛋白的纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HCMV IE86基因在大肠杆菌中的表达 |
| 4.2.2 GST-IE86融合蛋白的纯化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 可溶性GST-IE86融合蛋白 |
| 4.3.2 GST-IE86融合蛋白的纯化 |
| 4.3.3 HCMV IE86在昆虫细胞中的表达 |
| 4.4 小结 |
| Ⅴ HCMV IE86蛋白与通用转录因子和转录调控因子相互作用的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 IE86蛋白与通用转录因子TFⅡB的相互作用 |
| 5.2.2 IE86蛋白与转录调控因子SP1的相互作用 |
| 5.2.3 IE86蛋白与转录调控因子AP1的相互作用 |
| 5.2.4 IE86蛋白与转录调控因子AP2的相互作用 |
| 5.2.5 IE86蛋白与转录调控因子NF-κB的相互作用 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HCMV IE86蛋白的功能 |
| 5.3.2 转录因子 |
| 5.3.3 HCMV IE86蛋白与TFⅡB的相互作用 |
| 5.3.4 HCMV IE86蛋白与SP1的相互作用 |
| 5.3.5 HCMV IE86蛋白与AP1的相互作用 |
| 5.3.6 HCMV IE86蛋白与AP2的相互作用 |
| 5.3.7 HCMV IE86蛋白与NF-κB的相互作用 |
| 5.3.8 HCMV IE86蛋白激活基因转录机制 |
| 5.4 小结 |
| Ⅵ 总结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略（论文提纲范文）
| 1 肝炎病毒DNA/RNA结合蛋白基因的克隆化 |
| 2 肝炎病毒蛋白结合蛋白基因的克隆化 |
| 3 肝炎病毒蛋白反式激活基因的克隆化 |
四、抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究（论文参考文献）
- [1]针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体[D]. 王珵珵. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [2]大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析[D]. 张坤. 中国农业大学, 2017(05)
- [3]功能基因组学与肝脏疾病研究[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(01)
- [4]抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究[J]. 钟彦伟,成军,焦成松,张忠东,李强,李莉,陈菊梅. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [5]丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达[J]. 钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [6]HCV E1和HCMV IE86蛋白的性质和功能研究[D]. 徐进平. 华中农业大学, 2003(04)
- [7]病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略[J]. 成军. 解放军医学杂志, 2003(09)
- [8]抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A单链抗体的制备及免疫组织化学研究[J]. 钟彦伟,成军,焦成松,张忠东,李强,李莉,陈菊梅. 中西医结合肝病杂志, 2003(02)
- [9]应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因[J]. 牟劲松,刘妍,王刚,成军,段惠娟,李克,陆荫英,王琳,王惠芬. 世界华人消化杂志, 2003(04)
- [10]丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析[J]. 成军,李克,陆荫英,王琳,刘妍. 世界华人消化杂志, 2003(04)