一、骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究（论文文献综述）
石丽霞[1]（2021）在《黄芪活性多糖APS-Ⅱ三氟乙酸降解寡糖片段的免疫活性筛选与结构初探》文中研究说明选题依据:黄芪是多年生豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,在中医药研究中被推崇为补益良药,具有扶正固本、益卫固表的药理功能,在临床研究中具有数千年的历史。黄芪中的黄芪多糖（APS）为含量丰富、活性较强的天然成分,课题组前期研究发现分子量约为10 k Da的黄芪多糖组分APS-Ⅱ的免疫活性最强。但是多糖的分子量较大,结构分支复杂,且多糖标准品的缺乏也为其结构表征带来了巨大挑战。近年来,随着多糖受体理论学说的推广以及自上而下研究策略的指引,相对分子量相对较小的寡糖研究受到了广泛的关注,不仅可以促进多糖结构的研究,还对糖类药物的开发提供了新思路。然而,黄芪寡糖的研究还十分有限,因此本文将APS-Ⅱ采用三氟乙酸降解成寡糖,从寡糖水平研究APS-Ⅱ的免疫活性中心片段,有助于突破APS-Ⅱ结构研究的技术瓶颈,为黄芪糖类药物的研发及其构效关系奠定基础,进一步丰富多糖受体理论学说。目的:将黄芪免疫活性多糖通过单因素实验和正交试验确定最优酸解条件,按聚合度分布情况通过制备液相色谱仪分离制备不同寡糖片段,分析不同寡糖片段的结构组成并筛选出免疫活性较强的寡糖片段。方法:（1）中药黄芪利用水提醇沉法提取黄芪多糖,接着通过超滤机截留法制备黄芪免疫活性多糖,然后通过单因素实验以及正交试验优化三氟乙酸降解APS-Ⅱ的最佳酸解条件,该过程主要考察了酸解温度、酸解时间和酸浓度对降解产物的影响,最后在确保最优降解条件的重复性和稳定性以后批量制备黄芪寡糖（APOS）。（2）黄芪寡糖通过纯化制备色谱仪分离制备不同聚合度（DP）的黄芪寡糖片段,通过化学和仪器分析相结合的方法研究APOS的结构特征,采用超高效液相色谱-电喷雾电离高分辨飞行时间质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS）分析了混寡糖的质谱信息,用高效液相色谱仪对寡糖片段的聚合度进行分析,用完全酸水解结合衍生化的方法研究了寡糖片段的单糖组成,用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测定了寡糖片段中存在的特殊官能团结构,用气相质谱联用（GC-MS）的检测手段分析黄芪寡糖片段中单糖残基的连接方式。（3）利用多种体外免疫细胞的活性评价以及免疫球蛋白G（IgG）的试剂盒检测来探讨不同聚合度黄芪寡糖片段对免疫活性的影响:通过巨噬细胞的吞噬活性和自然杀伤细胞（NK）的细胞毒活性了解不同聚合度黄芪寡糖片段对固有免疫的影响;通过脂多糖（LPS）诱导脾淋巴细胞中T淋巴细胞的增殖以及刀豆蛋白A（ConA）诱导脾淋巴细胞中B淋巴细胞的增殖了解不同聚合度黄芪寡糖片段对适应性免疫的影响;用不同聚合度的黄芪寡糖片段干预小鼠脾淋巴细胞,通过检测脾细胞分泌IgG的情况来分析黄芪寡糖对特异性免疫的作用。结果:1.黄芪免疫活性多糖（纯度大于98.5%）利用三氟乙酸部分水解为寡糖的最佳条件为水解温度80℃,三氟乙酸浓度1.0 mol·L-1,水解时间1 h,该条件具有良好的重复性和稳定性（RSD%﹤3%）,重复批量制备表明APOS的产率约为75%。2.APOS经制备液相色谱的分离得到六个寡糖片段,APOS-1主要以DP2为主,APOS-2包括DP3～DP7,APOS-3包括DP5～DP9,APOS-4包括DP9～DP14,APOS-5包括DP12～DP17,APOS-6包括DP16～DP19。通过一系列的化学仪器分析表明APOS的糖链断裂呈规律性,表现为Ci、0,2Ai、2,5Ai、2,4Ai型的碎片离子,结构以→4)-Hex-(1→连接的六碳糖为主链,包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖,主要以葡萄糖为主要成分,此外在主链糖环的C2、C3和C6位存在支链结构,且C6位分支较多,并且APOS-5和APOS-6的主链糖环存在更复杂的多支链结构。3.不同聚合度寡糖片段对体外免疫细胞均具有免疫增强作用,平均分子量较大的组分显示出更强的免疫活性,与APS-Ⅱ相比,APOS-4/5/6表现出的差异活性具有统计学意义,且在200μg·m L-1时达到最强活性,推测在DP9以上的黄芪寡糖片段中更有可能存在免疫活性中心片段。结论:本研究以免疫活性多糖为研究对象,通过“自上而下”的研究策略使用三氟乙酸将APS-Ⅱ部分酸水解,得到不同聚合度的寡糖,并利用制备液相将寡糖分为六个片段,分析比较了不同寡糖片段之间的结构差异,表明APOS是以→4)-Hex-(1→连接的六碳糖为主链,在主链糖环的C2、C3和C6位存在分支的糖链结构,通过体外免疫活性筛选试验找到聚合度为DP9以上的高聚合度寡糖免疫活性最强,推测糖APS-Ⅱ中的免疫“活性中心”可能位于DP9以上的糖链结构中。本研究为进一步探索不同结构APOS与免疫活性之间的构效关系奠定了基础,也为其他植物多糖的寡糖研究提供了研究思路。
张利[2]（2021）在《CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究》文中指出骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种多发病于青少年的恶性肿瘤,易发生肺转移。对于转移性的骨肉瘤,手术治疗和放化疗的临床治疗效果不佳,患者的五年生存率低于30%,目前缺少有效的治疗方案。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）对肿瘤细胞的杀伤并不需要依赖于MHCI（Major histocompatibility complex class I molecule）类分子,可以有效的防止肿瘤逃逸。实体瘤特殊的免疫微环境使得CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织中,即使浸润到肿瘤组织中,也会因严峻的免疫抑制性环境而耗竭。NKG2D（Natural killer group 2D）是一种NK（Nature killer）细胞表面激活受体,当其与配体结合后通过激活下游信号通路使NK细胞释放各种细胞因子,进而发挥其杀伤肿瘤作用。在我们的研究中发现,OS组织中NKG2D配体蛋白MICA/B（MHC class I chain-related protein A/B）高表达,同时趋化因子CXCL13（chemokine C-X-C motif ligand 13）促进了骨肉瘤的转移和侵袭。CXCR5（C-X-C chemokine receptor type5）为CXCL13的受体;CXCL13可以趋化CXCR5+T淋巴细胞归巢到肿瘤组织发挥抑制肿瘤的作用。本研究制备人源和鼠源的CXCR5共表达的NKG2D-CAR-T细胞,探究CAR-T细胞的对骨肉瘤治疗作用及相关机制。第一部分共表达CXCR5的NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究制备人源对照CAR-T（Mock-CAR-T）,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞。对比于NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞向CXCL13细胞因子的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显加强;CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞激活相关的分子如TNF-α（Tumor necrosis factorα）、IFN-γ（Interferonγ）、CD107a和Gzm B（Granzyme B）的表达量显着提高,体外增殖能力显着增强,并且PD-1（Programmed cell death-1）和TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）的表达水平更低。RNA测序结果显示CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在增殖、记忆性分化、抵抗免疫耗竭和NFAT通路相关的基因表达显着提高。通过Western blotting、钙信号检测和NFAT-Jurkat报告基因等方法验证显示CXCR5-NKG2D-CAR-T通过CXCL13/CXCR5/Ca2+/NFAT信号轴提高了CAR-T细胞的综合效果。体内实验使用U-2OS细胞对NSG小鼠进行皮下荷瘤,建立骨肉瘤模型,检测CAR-T细胞对荷瘤小鼠的肿瘤杀伤情况。与NKG2D-CAR-T细胞相比,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞可以在体内存活时间更长,血液中CD8+T淋巴细胞的比例升高,实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。第二部分CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响构建鼠源的Mock-CAR-T,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞以及鼠源的CXCL13过表达骨肉瘤细胞系。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外趋化能力明显提高;并且展现出更强的骨肉瘤细胞杀伤能力;与细胞杀伤相关的分子如Gzm B,CD107a和IFN-γ的表达量明显提高;体外增殖能力得到明显的增强;并显着降低了耗竭相关的PD-1的表达量。将鼠源的骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨内进行原位建模。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,鼠源的CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在体内的存活时间、CD8+T淋巴细胞的比例和记忆性T细胞的分化方面展现出优势;并产生更好的肿瘤和淋巴结的归巢能力;产生更强肿瘤抑制效果;并显着降低了肿瘤中髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的比例;对抑制性的骨肉瘤免疫微环境有较好的改善作用。结论:CXCR5的共表达显着提高了NKG2D-CAR-T细胞的肿瘤趋化和杀伤能力,并改善了骨肉瘤免疫微环境,本研究为骨肉瘤的CAR-T细胞免疫疗法提出了一种新的方案。
孙悦文[3]（2020）在《诱导免疫原性细胞死亡的铂（Ⅳ）配合物合成及生物活性研究》文中提出近年来,化学免疫治疗在临床应用中取得了瞩目的成果,越来越多的人认为,为了诱导临床上有效的抗肿瘤反应,需要将免疫疗法与化学疗法相结合。除了联合疗法,有关化疗药物免疫调节性能的研究也引起了人们的重视。以顺铂、卡铂和奥沙利铂为代表的铂类药物是肿瘤治疗中使用最广泛的化学治疗药物,显示出对许多实体瘤的临床疗效,其主要的抗肿瘤机理是通过干扰DNA合成或对DNA产生化学损伤来促使细胞凋亡。近年来多例研究表明铂类药物可能还有除DNA以外的其他分子靶标,在这些脱靶效应中,铂类药物至少有部分抗肿瘤功效可以归因于其免疫调节机制。研究表明,铂类药物在发挥细胞毒性的同时,还能通过多种方式参与机体的免疫调节、恢复免疫系统的活力,其中以诱导免疫原性细胞死亡（ICD）最为常见。ICD诱导剂在体内激活的肿瘤特异性免疫反应会使那些未被原始药物毒性杀死的残留癌细胞受到“二次袭击”,可能会为患者带来长期的治疗益处。第1章首先简要介绍了肿瘤化学免疫治疗的基本概念以及研究现状,指出了目前化学免疫治疗存在的问题和未来的应用潜力,并总结了部分具有免疫活性的化疗药物调节免疫系统的基本原理。然后概述了铂类药物在化学免疫治疗中的应用进展和调节免疫系统的可能途径,并列举了若干具有免疫调节功能的传统及新型铂类配合物。其次介绍了ICD的定义、分子机制及其对于增强抗肿瘤免疫反应和改善患者临床疗效的重要意义。最后介绍了常见化疗药物中的ICD诱导剂,以及铂类ICD诱导剂目前的研究和开发现状。第2章我们选用具有ICD诱导功能的合成辣椒素对铂（Ⅳ）配合物进行双功能化修饰,得到了双取代配合物DCP。在对其结构进行表征后,我们首先检测了配合物的还原性及其与DNA的相互作用,结果显示DCP还原后形成的二价铂能够与DNA发生共价结合并破坏其右手螺旋结构。然后我们又对DCP的生物活性进行了初步探索。体外细胞毒活性和细胞凋亡试验表明,DCP能够显着抑制人胰腺癌细胞PANC-1的生长,且与相同浓度的顺铂相比,DCP能诱导更多的PANC-1发生晚期凋亡。在对其免疫原性诱导能力的测试中,我们发现DCP能促进肿瘤细胞表达损伤相关分子模式（DAMPs）,即钙网蛋白（CRT）的细胞表面暴露以及三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的胞外释放。诱导人外周血单核细胞（PBMC）免疫应答的相关试验结果表明,经DCP处理的细胞条件培养基可以促进促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放,并导致PBMC对癌细胞的细胞毒性上升。综上所述,配合物DCP对选取的人胰腺癌细胞株PANC-1有较好的细胞毒性,并且实现了诱导ICD的设计目标,能够促进ICD相关DAMPs的表达上调,这些DAMP信号可以进一步激活PBMC并增强其对癌细胞的细胞毒性作用。这项工作作为开发新型铂类ICD诱导剂的尝试之一,为基于铂药的联合化学免疫疗法的发展奠定了基础。
郑佳彬[4]（2020）在《复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究》文中进行了进一步梳理立题依据:研究背景:恶性淋巴瘤（ML）是一组起源于淋巴系统的恶性肿瘤,多发生于淋巴结和（或）结外部位淋巴组织,通过肿瘤细胞表面的白细胞分化抗原不同可将其分为T细胞来源淋巴瘤及B细胞来源淋巴瘤两大类。T细胞淋巴瘤临床较B细胞淋巴瘤较为少见,仅约占所有淋巴瘤的10%-15%。但这类淋巴瘤由于其亚洲人群高发病率、明显的个体异质性、广泛的症状特异性、较差的治疗预后和转归及大多数在治疗2-3年内复发的特点,也一直受到国内外学者的广泛重视。复方苦参注射液由于其抗肿瘤、镇痛、增强免疫等功效,常用于晚期患者的维持治疗及放化疗辅助治疗。中国中医科学院首席研究员、中国中医科学院广安门医院肿瘤科前主任林洪生教授在多年的淋巴瘤患者诊治过程中发现复方苦参注射液在治疗缓慢进展的T细胞淋巴瘤,尤以伴以多种形式皮肤损伤的患者效果显着,填补了缓慢进展或除皮肤受累症状外并无其他淋巴结或结外器官受累症状的患者等待观察期无药可用的空白,缓解了患者症状,显着改善生活质量。研究目的:本研究分别通过体内及体外实验设计,探索复方苦参注射液对不同人源淋巴瘤细胞系的干预作用,并在小鼠体内模型中进一步验证和探索其免疫调控作用机制。为复方苦参注射液临床有效性是否源于其对淋巴瘤抑制调节作用提供进一步科学依据。研究方法:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响1.1复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选分别培养Hut78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞株）、Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Jurkat（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Raji（人源B细胞淋巴瘤细胞株）、EL4（鼠源T淋巴细胞白血病细胞株）5种不同淋巴瘤细胞株。通过比较CCK8及prestoblue敏感度及复方苦参注射液颜色带来的影响,选择prestoblue法作为细胞活力检测试剂。使用prestoblue法及细胞计数法重复验证不同浓度（0.039-5mg/ml）复方苦参注射液对不同细胞株干预后24h、48h、72 h、96h后对其增殖的影响。从而筛选增殖抑制有效及敏感的细胞株。1.2复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用对上一步筛选敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用PI染色,通过流式细胞仪检测细胞周期,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞周期的调节作用。1.3复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响对敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用7AAD/AnnexinV双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞凋亡的诱导作用。并通过Western Blot法检测凋亡相关内切酶casepase3、casepase7表达进一步证实凋亡的发生。2.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响应用反向蛋白阵列术（RPPA）检测敏感细胞株Hut78经不同剂量复方苦参注射液干预24h后蛋白表达差异,聚类分析潜在作用通路,蛋白质印迹法（WB）验证相关有效通路蛋白在复方苦参注射液干预的Hut78、Loucy细胞蛋白表达中的影响,明确复方苦参注射液抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等生物学行为的调控机制。3.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响使用高压液相和质谱联用的方法定量检测敏感细胞株Hut78、Loucy经不同剂量复方苦参注射液干预24h后代谢产物表达差异,明确复方苦参注射液影响肿瘤细胞能量代谢生物学行为的调控机制。4.复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型的体内实验研究4.1复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为低、中、高剂量（2ml/kg、4ml/kg、8ml/kg）复方苦参注射液组,甲氨喋呤（MTX）组,生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠14天,观察记录其对瘤体大小、小鼠体重及生存期的影响,探索CKI治疗的最佳剂量。4.2复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为最佳剂量复方苦参注射液组（2ml/kg,4ml/kg）及生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠7天,观察比较瘤体大小,绘制瘤体生长曲线;通过免疫细胞亚群测定检测小鼠肿瘤及脾脏免疫细胞分型表达;通过高压液相和质谱联用的方法进行肿瘤组织代谢产物检测。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制;小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色用以检测肿瘤组织凋亡情况。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制。研究结果:1.通过细胞活力鉴定的方法学摸索,CCK8及Prestoblue均具有良好的敏感性,但复方苦参注射液颜色对Prestoblue读数的影响程度更小。因此选择prestoblue法及细胞计数法重复验证CKI在淋巴瘤细胞增殖中发挥的作用。Prestoblue法结果显示复方苦参注射液对5种淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中T细胞淋巴瘤细胞系Hut-78、EL4、Loucy、Jurkat要显着强于B细胞淋巴瘤细胞Raji,在人源T细胞淋巴瘤细胞系中,复方苦参注射液对Hut-78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞）抑制效果最强,Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）的抑制效果次之,均呈现显着的剂量及时间依赖性。细胞计数法结果与Prestoblue检测结果趋势一致,也进一步验证Prestoblue细胞增殖-活力检测方法检测结果的真实性及准确性。细胞周期检测结果显示CKI处理后Hut-78、Loucy细胞的细胞周期G0-G1,S,G2/M期并未见明显的周期停滞作用。但是subG 1期的比例呈明显剂量依赖性增加,提示细胞凋亡在CKI的作用机制中或许扮演着重要作用。细胞凋亡检测结果显示CKI可以诱导Hut-78、Loucy细胞的凋亡,凋亡相关内切酶casepase3、casepase7蛋白表达的Western Blot检测也进一步证实了这一点。不同的是,CKI在48h更多的引起Hut-78细胞的早期凋亡,其凋亡率增高明显;但在Loucy细胞中,晚期凋亡和坏死细胞比率更多,这说明CKI诱导Loucy细胞死亡的方式或机制与Hut-78可能纯在差异。2.通过分析反向蛋白阵列术（RPPA）结果发现CKI的潜在作用通路可以聚焦在 PI3K/Akt/mTOR、NF-KB、MEK/ERK 等通路,其中 PI3K/Akt/mTOR 通路的多数蛋白表达调节符合CKI调节分子机制的构想。Western Blot验证结果证实CKI可通过下调Hut-78细胞中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达,进一步调控其下游AMPK/TSC1/mTor/S6通路,从而影响细胞增殖或诱导凋亡。这种现象在Loucy细胞中同样可见。可见,调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制。3.高压液相和质谱联用的方法检测提示CKI具有潜在调控谷氨酸及乳酸代谢的作用。CKI可以通过直接减少谷氨酸或乳酸代谢的途径抑制糖解途径酵,减少肿瘤能量代谢。Western Blot蛋白表达验证结果证实CKI具有潜在下调GLS1、LDHA蛋白表达的作用,从而干预肿瘤能量代谢途径,减少肿瘤能量供应。4.通过对C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,我们发现CKI、MTX干预相比生理盐水组可显着提高生存率,延长生存期,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用。比较两个实验的小鼠瘤体生长曲线,发现CKI干预后瘤组织的瘤体积增长速度呈降低趋势,与生存期研究结果相一致,相较于化疗药物MTX,CKI依然表现出非劣势的肿瘤抑制作用。免疫细胞亚群结果提示CKI可以选择性上调T细胞亚群（CD3+）,而其中发挥作用的主要免疫细胞群体可能是上调辅助T细胞（CD3+CD4+）、调节性T细胞（CD4+FoxP3）,或下调Th17细胞（CD3+CD4+IL17）比例达成的。这一发现提示CKI的抗肿瘤作用可能与免疫调控有关。通过对肿瘤组织代谢产物的高压液相和质谱联用的方法发现CKI在谷氨酸途径代谢中,可以显着降低谷氨酰胺、谷氨酸及乳酸含量。这与Hut-78及Loucy的实验结果相一致,也进一步提示CKI可以通过抑制谷氨酸及糖酵解途径影响肿瘤能量代谢,降低肿瘤供能,从而发挥抑制肿瘤生长的作用。小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色的结果显示CKI的抑瘤作用可能是通过诱导细胞凋亡产生的,这也进一步印证了体外实验的结论。研究结论:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中对T细胞淋巴瘤要显着强于B细胞淋巴瘤。其发挥细胞增殖抑制的作用可能是通过诱导细胞凋亡完成;2.调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制;3.CKI具有降低谷氨酸及乳酸代谢的作用,从而抑制糖解酵途径,减少肿瘤能量代谢,这一点在体内外实验中均得到了验证;4.CKI干预EL4淋巴瘤动物模型可以提高生存率,延长生存期,降低肿瘤生长速度,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用;5.CKI发挥肿瘤免疫调节的机制可能是下调Th17（CD3+CD4+IL17）/Treg（CD4+FoxP3）比例,提示CKI的抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤相关性炎症发挥的。
王盛东[5]（2020）在《丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应》文中进行了进一步梳理骨肉瘤是发病率最高的原发恶性骨肿瘤,常见于儿童和青少年,具有局部侵犯和早期肺转移的趋势。通过使用新辅助化疗联合手术的治疗方案,已经将骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%-80%,但在过去的近40年间并未得到进一步改善。尤其是对于复发和发生肺转移的患者,目前尚无有效的治疗手段,预后极差。同时,目前临床的一线化疗药,如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺等毒副作用很大,且耐药的情况常有发生,疗效有限。因此,寻找新型、高效和安全的治疗方案是目前亟待解决的问题。免疫治疗被认为是除手术、化疗、放疗以外的第四大治疗手段。其中,过继细胞输注治疗（ACT）是最有前景的免疫治疗方案之一,已经在白血病的研究中取得了显着的成果。包括NK细胞、巨噬细胞和T细胞在内的各种免疫细胞均被研究应用于ACT中,尤其是T细胞,因其在抗肿瘤免疫效应中扮演着重要角色,成为ACT的首选效应细胞。然而,包括骨肉瘤在内的多数实体肿瘤,都缺少特异性、高表达的免疫治疗靶点,成为了ACT应用的一个主要限制因素。γδT细胞占外周血T细胞的1～10%,因其能够直接识别肿瘤细胞并且不依赖MHC的限制而被认为是充满前景的效应T细胞。活化的γδT细胞能够产生穿孔素、颗粒酶和炎症因子直接杀伤被识别的肿瘤细胞,从而产生有效的抗肿瘤效应。本课题组在先前研究已经证实通过唑来膦酸（ZOL）预处理后,γδT细胞能够在体外对骨肉瘤细胞和软骨肉瘤细胞产生显着的杀伤效应。因而,过继转移γδT细胞有望成为治疗包括骨肉瘤在内的各种恶性实体肿瘤的一种有效治疗方案。然而,大量体外研究显示诱导γδT细胞产生强大的免疫效应所需的ZOL浓度较高,已超出体内实验和临床应用所能长时间维持的浓度。因而,我们需要寻找有效的佐剂以增强ZOL的作用,从而降低其诱导γδT细胞发挥显着免疫效应所需的浓度,促进该方案的临床应用。丙戊酸钠（VPA）是已经得到FDA批准的一种去乙酰化酶抑制剂,临床广泛应用于抗癫痫治疗。近年来研究显示VPA还具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的潜在作用。不仅如此,VPA还表现出能够增强包括放疗、化疗和多种免疫治疗杀伤肿瘤效应的潜能,并且对正常组织毒性较小。早有研究报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂或许具有增强γδT细胞免疫效应的作用,其中VPA似乎与γδT细胞的多种功能相关,具体仍有待进一步阐明。综上,我们推测VPA能够联合ZOL发挥协同作用,显着增强γδT细胞介导的抗骨肉瘤免疫效应。本次研究中,我们发现VPA能够显着的增强ZOL诱导的γδT细胞抗骨肉瘤效应,表现出协同作用。并且,相比单药刺激,VPA联合ZOL刺激的γδT细胞,表达更高水平的细胞毒作用相关的标记分子和炎症因子等,包括CD107a、Perforin和IFN-γ等。我们进一步发现VPA和ZOL能够协同阻断甲羟戊酸途径,引起中间产物积聚,从而激活γδT细胞。我们还通过建立免疫缺陷鼠骨肉瘤模型,进行过继输注γδT细胞实验。结果显示,相比单ZOL处理组,VPA联合ZOL能够显着增强γδT细胞的体内抗骨肉瘤效应,有效抑制骨肉瘤的增长,并促进T细胞的浸润。组织学检测也显示联合处理组表现出最显着的甲羟戊酸通路阻断效果。我们还搜集了7例骨肉瘤临床样本,来自原发、复发、转移和化疗耐药等不同患者,分离培养获得原代骨肉瘤细胞。实验结果表明VPA联合ZOL能够协同增强γδT细胞杀伤原代骨肉瘤细胞的作用,为该治疗方案的临床试验提供依据。综上,本研究表明VPA联合ZOL能够协同阻断甲羟戊酸通路,引起中间产物积聚,从而刺激γδT细胞发挥强大的杀伤骨肉瘤效应。
杨敏[6]（2020）在《免疫检查点分子TIM-3在肿瘤免疫中的作用及机制》文中提出第一部分 TIM-3在肿瘤微环境中的表达及靶向TIM-3抗肿瘤作用机制背景:近年来,肿瘤的免疫治疗取得了令人瞩目的革命性临床效果。尽管针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性死亡受体1（PD-1）的免疫检查点阻断为策略的肿瘤免疫治疗在临床上取得了巨大的成功,但大部分癌症患者尚未从这种新型疗法中获益。如何提高免疫检查点抑制剂对肿瘤治疗的响应率是当前肿瘤治疗的重大课题。除了 PD-1和CTLA-4外,还有多种免疫调节分子在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中表达。以这些分子作为靶点的免疫治疗有望成为改善现有免疫治疗的有效途径。研究发现,T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构-3（TIM-3）在感染,同种免疫,自身免疫,移植免疫以及肿瘤免疫小鼠模型中介导免疫耐受。之前的研究发现TIM-3在非小细胞肺癌（NSCLC）患者的调节性T细胞（Treg）中高表达,并且CD4+T细胞中TIM-3的表达比例较高,与癌症患者的临床病理参数不良相关。另外大量的数据显示TIM-3在肿瘤组织中特异性表达。因此,靶向TIM-3可能成为进一步改进当前免疫疗法的新策略。尽管大量实验数据显示TIM-3在体内具有免疫抑制功能,但具体机制尚不明确。为了有效靶向TIM-3用于肿瘤免疫治疗,需要对TIM-3介导的免疫抑制进行进一步深入的机制研究。本项研究将为其他免疫检查点阻断剂新型联合治疗的合理设计提供思路。目的:研究免疫检查点分子TIM-3在肿瘤微环境中的表达分布及其表达意义;探讨TIM-3单克隆抗体联合PD-1单克隆抗体在多种小鼠肿瘤模型中的治疗作用及作用机制;揭示肿瘤免疫治疗的耐受机制。方法:利用流式细胞术检测TIM-3在荷瘤小鼠中肿瘤浸润淋巴细胞各个亚群的表达分布;检测肿瘤浸润淋巴细胞中TIM-3+各亚群的活化、增殖水平以及免疫卡控点分子以及效应分子的表达情况;同时利用Mitotracker Deep Red试剂盒检测肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞亚群中的线粒体总体数量;利用Seahorse实验检测肿瘤浸润淋巴细胞亚群的耗氧效率及糖酵解水平;利用细胞毒杀伤实验检测肿瘤浸润淋巴细胞亚群的特异性杀伤作用;利用TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗荷瘤小鼠,观察小鼠生长曲线,总体生存期或肺转移结节数量;利用流式细胞术检测抗体治疗后24小时或96小时的荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的群体分布变化及群体表型变化;根据荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞群体表型变化提示,设计改进的肿瘤免疫治疗方案,利用TIM-3,PD-1和LAG-3单克隆抗体同时治疗荷瘤小鼠,观察小鼠生长曲线;利用流式细胞术检测三联组合抗体治疗后24小时荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞群体的分布及表型变化;利用细胞毒杀伤实验检测抗体治疗后肿瘤浸润淋巴细胞的特异性杀伤功能。结果:我们发现TIM-3高表达于肿瘤浸润CD4+,CD8+细胞,Treg细胞,)型树突状细胞及I型肿瘤相关巨噬细胞。特别是在Treg上,TIM-3表达比例约80%。TIM-3+的CD4+及CD8+T细胞高表达CD44、OX40等T细胞活化分子及细胞增殖相关分子Ki67,低表达CD62L,IL7R等幼稚T细胞分子。研究进一步发现T细胞效应分子IFN-γ与颗粒酶B主要表达在TIM-3+T细胞群体。尽管普遍认为肿瘤中的PD-1+TIM-3+T细胞是耗竭T细胞,但从几个指标如线粒体总量,糖酵解水平来看,PD-1+TIM-3+较PD-1-TIM-3-T细胞群体是活化更高的效应细胞,并且具有更高水平的特异性杀伤作用。相比PD-1单克隆抗体单独治疗,TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗能够显着抑制小鼠肠癌MC38的生长;TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗能够显着延长卵巢癌荷瘤小鼠的生存期,而PD-1单克隆抗体单独治疗并不能延长荷瘤小鼠生存期。并且,联合治疗组中的无荷瘤小鼠再次接种肿瘤后,小鼠受免疫保护不再成瘤。在小鼠乳腺癌4T1模型中,TIM-3与PD-1单克隆抗体单独或联合治疗都不影响肿瘤生长速度。PD-1抗体单独治疗不能抑制肿瘤的肺转移,但是TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗能够显着减少4T1肿瘤的肺部转移结节数量。通过流式细胞术分析,我们发现TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗24或96小时后能够显着增强CD8+与CD4+T细胞的增殖与效应功能,包括颗粒酶A/B或IFNγ的表达比例增加。同时发现,TIM-3抗体与PD-1抗体联合治疗24或96小时后,另一个免疫抑制受体分子LAG-3显着上调。使用TIM-3,PD-1以及LAG-3单克隆抗体联合治疗后发现,三者的联合治疗能够进一步改善TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗的效果,并且治疗效果的改善与CD8+T细胞表达的颗粒酶B的比例上调有关。细胞毒杀伤实验进一步验证了 TIM-3,PD-1以及LAG-3单克隆抗体联合治疗显着改善了 CD8+T细胞特异性细胞毒杀伤作用。结论:TIM-3是肿瘤中T细胞的一个活化标志,TIM-3+肿瘤浸润T细胞是效应性T细胞。在MC38小鼠肿瘤模型中,TIM-3+PD-1+群体不是耗竭T细胞群体,而是高度活化的效应性T细胞。TIM-3单克隆抗体能够联合PD-1单克隆抗体在多种肿瘤模型中显着改善PD-1抗体的免疫治疗效果,克服一些肿瘤对PD-1单克隆抗体的耐药性。肿瘤浸润T细胞的高度活化导致上调TIM-3,PD-1,LAG-3以及GITR等免疫检查点分子,这些分子相互交叉调控表达以控制肿瘤微环境中活化的T细胞功能。TIM-3,PD-1以及LAG-3单克隆抗体三者联合治疗能够进一步改善TIM-3与PD-1抗体的联合治疗效果,增强肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒作用。第二部分 人源化TIM-3单克隆抗体的功能作用研究背景:TIM-3被认为是抗肿瘤免疫应答的负性调控分子。TIM-3的以下几个特性使其成为改进现有免疫疗法的理想靶标。首先,TIM-3特异性高表达于肿瘤浸润T细胞,可通过靶向肿瘤浸润T细胞进行更精确的治疗,能够降低非特异性毒性。其次,TIM-3下游的信号转导与CTLA-4和PD-1的信号转导不同,使其能够与CTLA-4或PD-1抗体联合使用。第三,一些临床前数据显示,TIM-3抗体与PD-1抗体联合作用具有比PD-1抗体单独作用更好的效果。因此,单独靶向TIM-3以及联合PD-1或CTLA-4单克隆抗体的肿瘤免疫治疗具有巨大潜力。第一部分的数据显示在肿瘤微环境中TIM-3表达于大部分Treg,CD4+以及CD8+T细胞。我们也证明了在多种小鼠肿瘤模型包括结直肠癌,卵巢癌以及乳腺癌模型中,PD-1与TIM-3单克隆抗体联合治疗克服了单独使用PD-1抗体的耐药性,并且改善了 PD-1抗体的治疗疗效。TIM-3与PD-1单克隆抗体联合治疗能够显着增强CD4+与CD8+T细胞的增殖和效应功能。这些数据都说明TIM-3作为新型的肿瘤免疫治疗靶点,在临床上具有很大的潜力。亟需开发针对人TIM-3的抗体,改善现有肿瘤免疫治疗的困境。目的:开发靶向人TIM-3的单克隆抗体;筛选亲和性高并能够阻断TIM-3与其配体PtdSer结合的单克隆抗体;研究人源化抗体在体外对T细胞的功能作用;研究抗体在人源化小鼠模型中的抗肿瘤功能。方法:构建稳定表达TIM-3的细胞株,并利用流式细胞术筛选亲和性较高的杂交瘤克隆株;体外UV辐照诱导小鼠脾脏细胞凋亡,流式细胞术验证磷酰酯丝氨酸暴露于凋亡细胞表面,并且验证磷酰酯丝氨酸作为配体与TIM-3的结合能力;利用流式细胞术检测TIM-3抗体阻断TIM-3与其配体磷酰酯丝氨酸结合的能力;体外诱导T细胞表达TIM-3,并且在TIM-3抗体存在的情况下,体外重新再刺激高表达TIM-3的T细胞,ELISA法检测TIM-3抗体对T细胞分泌IFN-γ的作用;利用人源化小鼠模型,使用TIM-3单克隆抗体或PD-1单克隆抗体,或TIM-3与PD-1单克隆抗体联合或IgG对照对人HT29结直肠癌治疗,检测TIM-3单克隆抗体在人源化体系中对肿瘤治疗的功效。结果:本项研究构建了过表达人以及猴TIM-3 IgV结构域的质粒,并通过稳转筛选,流式分选得到稳定表达细胞株。利用稳定表达TIM-3 IgV结构域的细胞株,筛选出能够结合人以及猴TIM-3 IgV结构域的杂交瘤克隆株,并筛选出结合能力较强的克隆株。筛选出的克隆株经过人源化改造后,并在工业生产表达体系中表达、纯化出单克隆抗体。利用过表达TIM-3 IgV结构域的稳转细胞株,验证了工业表达体系生产的人源化抗体能够结合TIM-3 IgV结构域。同时,在体外诱导凋亡细胞,并验证了磷脂酰丝氨酸在凋亡细胞上的暴露。研究发现,筛选的抗体能够有效的阻断TIM-3融合蛋白与其配体磷脂酰丝氨酸的结合。在抗体的功能研究中发现,体外刺激活化T细胞可诱导表达TIM-3,TIM-3+CD4+T细胞比例可达48%以上,TIM-3+CD8+T细胞比例达77%以上。当在TIM-3单克隆抗体存在的条件下重新刺激这些T细胞时,筛选的TIM-3单克隆抗体candidate 1能够显着增加T细胞分泌IFN-γ的量。在TIM-3抗体candidate 1体内功能研究中,利用NSG人源化小鼠模型,回输人PBMC后接种人结直肠癌细胞株HT29。研究发现,PD-1抗体Nivolumab能够轻微减缓肿瘤生长速度。人TIM-3抗体candidate 1与Nivolumab联合治疗与Nivolumab抗体单独治疗组相比能够显着抑制肿瘤的生长速度。结论:本项研究成功筛选出与人及猴TIM-3亲和性高,并能够有效阻断TIM-3与其配体磷脂酰丝氨酸结合的单克隆抗体。此外,对其中亲和性最高的单克隆抗体ca ndidate 1进行了功能鉴定,证明了 candidate 1能够在体外增强T细胞的效应功能,并能够在体内与Nivolumab协同发挥抗肿瘤功能作用。第三部分 TIM-3在调节性T细胞上的功能作用研究背景:调节性T细胞（Treg）在机体感染和损伤期间起到维持免疫耐受,预防自身免疫及自身炎症疾病等作用。Treg是细胞免疫中至关重要的成分,是维持机体免疫应答平衡的关键因素。Foxp3缺陷型小鼠以及Foxp3等位基因缺陷的人会产生严重的全身性器官特异性自身免疫疾病和淋巴组织增生疾病。Treg在抑制抗肿瘤免疫应答与移植耐受中也发挥至关重要的作用。Treg细胞存在于正常的组织中,但是比例较低。在不同的组织中,Treg细胞表达不同的趋化因子受体与粘附分子。但是Treg细胞是如何在组织中富集并发挥功能作用的机制尚不明确。在肿瘤中,Treg细胞可占CD4+T细胞的30%-50%。研究显示肿瘤浸润Treg细胞上调多种免疫调控受体,包括CTLA-4,ICOS,TIM-3以及GITR等,以及抑制性细胞因子白介素-10（IL-10）,转化生长因子β（TGFβ）等。本团队之前报道了在非小细胞肺癌患者中TIM-3在肿瘤浸润Treg细胞中高表达。最近研究进一步报道显示TIM-3+Treg 比 TIM-3-Treg抑制功能更强。除了肿瘤组织以外,TIM-3也被证实在其他一些组织中表达。这些研究提示TIM-3可能参与调控Treg细胞在组织中发挥的作用。在第一部分的研究中,我们同样证明了在肿瘤中Treg细胞特异性上调TIM-3的表达。然而,TIM-3在肿瘤Treg细胞中具体发挥何种作用以及作用机制尚不明确。目的:为了进一步阐明TIM-3在肿瘤组织Treg细胞中的作用和分子机制,利用Affymetrix人全基因组表达芯片研究人组织中TIM-3+Treg与TIM-3-Treg的基因表达差异,进一步理解TIM-3在Treg中表达的意义;构建Treg细胞条件型敲除TIM-3小鼠;进一步检测TIM-3在Treg细胞中缺失后对肿瘤生长的影响,并研究TIM-3对Treg功能的调控机制。方法:从人头颈鳞状细胞癌组织中分选出TIM-3+Treg细胞与TIM-3-Treg细胞,并使用Affymetrix Human Transcriptome Array 2.0基因芯片进行基因表达差异分析,系统地研究两种Treg细胞亚群的基因表达差异;利用CRISPR技术构建Treg细胞条件型敲除TIM-3小鼠,并检测确认TIM-3在Treg中特异性敲除;接种免疫原性较高的肠癌MC38肿瘤细胞与免疫原性较低的黑色素瘤B16肿瘤细胞,观察TIM-3在Treg细胞中敲除后对肿瘤生长的影响;流式分析肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的分布及表型特征的变化;体外分选肿瘤组织中的Treg细胞,并建立微型Treg抑制实验检测TIM-3敲除后对Treg抑制功能的影响。结果:通过流式细胞术分选出人头颈鳞状细胞癌组织中的TIM-3+Treg细胞与TIM-3-Treg 细胞,利用 Affymetrix Human Transcriptome Array 2.0 基因芯片进行基因表达分析,结果发现TIM-3+Treg细胞与TIM-3-Treg细胞有大量差异表达的基因,并且TIM-3+Treg细胞高表达效应T细胞标志的分子,TIM-3-Treg细胞高表达幼稚T细胞标志分子。我们进一步构建了 TIM-3+/-与TIM-3f/+小鼠,并通过与Foxp3YPF-Cre小鼠杂交后最终获得TIM-3+/-Foxp3Cre与TIM-3f/-Foxp3Cre基因型小鼠用于研究TIM-3在Treg细胞上的功能。通过流式细胞术检测肿瘤组织中Treg上TIM-3的表达,确认了TIM-3f/-Foxp3Cre小鼠在Treg细胞中特异性敲除TIM-3。研究发现免疫原性较强的MC38肿瘤在TIM-3f/-Foxp3Cre小鼠中的生长速度比TIM-3+/-Foxp3Cre对照小鼠显着迟缓,但B16小鼠肿瘤的生长并没有受到TIM-3在Treg细胞中缺失的影响。通过流式细胞术分析肿瘤微环境中的淋巴细胞分布及表型,我们发现TIM-3在Treg细胞中缺失后,肿瘤浸润免疫细胞增加,Th1和CD8+T细胞介导的免疫应答增强。此外,通过体外建立微型Treg抑制实验,发现来自TIM-3f/-Foxp3Cre荷瘤小鼠肿瘤组织中的Treg细胞抑制应答细胞增殖能力降低。这些结果说明TIM-3对于肿瘤组织Treg的免疫抑制功能是必需的。结论:人的癌症组织样本基因芯片表达显示TIM-3+Treg细胞是效应Treg细胞。条件型敲除TIM-3后,Treg抑制功能降低。在肿瘤模型中,TIM-3在Treg细胞中的缺失导致肿瘤免疫抑制的降低,免疫原性较高的肿瘤细胞生长得到控制。TIM-3在Treg细胞中的缺失造成肿瘤浸润淋巴细胞增多,Th1和CD8+T细胞介导的免疫应答增强。因此,TIM-3对Treg的抑制功能非常重要,特异性靶向Treg中的TIM-3能够极大程度提高肿瘤免疫治疗的疗效。
王战[7]（2020）在《DNA甲基化调控CXCL12在介导骨肉瘤进展和免疫应答中的作用》文中研究说明骨肉瘤是一种最常见的骨原发恶性肿瘤,其恶性程度较高,常见于儿童和青少年,其次为老年人（双峰现象）,容易发生转移,最常见部位为肺部,而肺转移往往是骨肉瘤治疗失败的主要原因,其5年总生存率不足20%。目前,骨肉瘤肺转移的机制尚不清楚,而免疫疗法等新颖治疗方式仍然存在一定挑战。越来越多的肿瘤免疫学研究聚焦于趋化因子。一方面,趋化因子可以激活和增强各类免疫细胞发生迁移,另外一方面,趋化因子可增强肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。趋化因子12（CXCL12）在肿瘤发生与发展过程中存在两面性,即CXCL12在趋化因子梯度驱动下既参与肿瘤转移又参与T细胞归巢的过程。此外,CXCL12-CXCR4生物轴与骨肉瘤患者预后之间的关系仍存在争议。第一部分探讨CXCL12-CXCR4生物轴在骨肉瘤中的作用,我们发现骨肉瘤通过DNA甲基转移酶1（DNMT1）甲基化调控CXCL12表达,进而影响肿瘤细胞增殖、迁移和转移。第二部分探讨骨肉瘤内CXCL12的异常表达对肿瘤内免疫细胞的影响以及首次联合CXCL12和CXCR4两个分子探讨该生物轴与骨肉瘤患者预后的相关性。流式技术和组化结果表明肿瘤内CXCL12的浓度与淋巴细胞的数量呈正相关,突显了CXCL12在淋巴细胞归巢中的重要性。此外,CXCR4negCXCL12hi组患者的预后最好,CXCR4posCXCL12lo组患者的预后最差,提示该轴尤其是CXCL12,可以作为临床治疗的潜在分子靶点,为后续去甲基化治疗骨肉瘤及其免疫应答中的作用提供新思路。第三部分进一步探讨DNA甲基化调控CXCL12在介导骨肉瘤进展和免疫应答中的具体作用。我们发现抑制DNMT可促进人骨肉瘤细胞CXCL12表达,利用地西他滨（DAC,DNMT抑制剂）去甲基化治疗免疫健全小鼠骨肉瘤模型,可显着提高肿瘤内CXCL12的表达,从而引起强烈的免疫反应,同时显着抑制肿瘤生长和肺转移,而阻断CXCL12-CXCR4轴或删除CD8+T细胞可以逆转结局。此外,我们发现地西他滨体外治疗可抑制骨肉瘤细胞增殖,体内治疗不促进肿瘤生长。综上所述,本研究阐明了CXCL12在骨肉瘤进展和免疫反应中的发挥重要调节作用,为靶向CXCL12治疗骨肉瘤提供了基础。
李胜[8]（2019）在《唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用》文中研究说明目的:骨肉瘤来源于间叶组织,多发生在骨组织,是一种常见于青少年或儿童的恶性骨肿瘤,男性患者多于女性,它的病程进展快、肺部转移早、预后不良、易复发,甚至死亡。目前骨肉瘤的治疗包括通过手术措施尽量完整切除病灶以及围手术期的抗肿瘤的综合辅助治疗。新辅助化疗作为化疗的首选,其不仅可以增加手术的安全性,而且能够为患者量身定制合适的假体做好准备。但目前化疗的药物品种有限,常伴随明显的全身毒副反应,给患者带来痛苦,寻找更多有效、副作用小的药物以及阐明其作用原理势在必行。唑来膦酸是具有代表性的、副作用小的第三代二膦酸盐,它具有骨代谢调节的特性,在体外能够起到抑制破骨细胞活动的作用,进而导致破骨细胞调亡,所以能够抑制骨破坏活性增加诱发的骨质吸收。另外有研究显示,唑来膦酸还可以抑制或粘滞肿瘤细胞基质释放的多种刺激因子引起的破骨细胞活动增强和骨钙释放,从而减缓骨转移的进展和发生,并可一定程度上的导致骨肉瘤细胞的死亡。PI3K/AKT信号通路是参与多数细胞的分化调节、生长、繁殖的信号转导通路。AKT别称蛋白激酶B在活化后,继续激活它的下游因子（GSK-3β等）,起到调节细胞周期、凋亡的作用。糖原合成激酶3β是关键的糖原合成酶,依赖其底物的磷酸化调节多个重要的细胞信号通路。大量的研究结果表明GSK-3β在骨肉瘤中表达增高,抑制其活性骨肉瘤细胞凋亡发生改变。Wnt信号通路参与骨髓基质干细胞的分化与更新,影响成骨及破骨细胞的生成分化,调节骨骼修复,对骨骼的生长发育、再生、重塑起到关键作用。Wnt信号通路能够引起β-连环蛋白β-Catenin的降解复合体包括Axin、APC、CK1、GSK-3β等,使细胞内β-Catenin积累、游离的β-Catenin进入细胞核,从而调节基因表达。本文旨在研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响;唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后PI3K-AKT、Wnt信号通路相关重要蛋白、基因表达影响。研究方法:1、采用MTT法检测骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸后24、48、72h后细胞活力变化;在50%抑制率药物浓度时间作用后,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞活力变化。2、划痕实验明确骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸,24、48、72h后细胞侵袭迁移力及凋亡状态;3、透射电镜观察骨肉瘤MG-63细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;4、流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;5、蛋白印迹方法Western Blot检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后,随着唑来膦酸作用药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸100μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的蛋白表达情况。结果:1、MTT结果显示,骨肉瘤MG-63细胞随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞活力抑制率及凋亡程度增加,50%抑制率约为药物100μmol/L作用48h;单纯GSK-3β抑制剂组与对照组比较无明显差异,GSK-3β抑制剂+实验药物组结果能够抑制细胞活力,但与相同条件实验药物组比较具有保护细胞活力的作用。2、划痕实验结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞迁移能力受到抑制,细胞出现明显凋亡变化。3、透射电镜结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞结构完整;实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡明显,以实验药物组效果显着。4、流式细胞仪检测结果显示,骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞轻度凋亡,实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡程度明显,以实验药物组凋亡率更高。5、蛋白印迹方法Western Blot结果显示骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白结果表达相当;实验组及GSK-3β抑制剂+实验药物组的β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白表达下降,以实验组显着;骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后及100μmol/L作用24、48、72h后的结果显示,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达降低。结论:1、唑来膦酸在体外具有抑制骨肉瘤MG-63细胞生长、促进其凋亡的作用;2、唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后,GSK-3β下游的蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达降低;实验组给予GSK-3β抑制剂Li2CO3后,β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的表达较实验组升高,说明唑来膦酸通过GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。3、唑来膦酸可以使P-AKT、PGSK-3β表达下降,进而影响其下游蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达下调,说明唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。
吴迪[9]（2019）在《卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究》文中研究说明卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占85%-90%。尽管化疗方案不断优化,但是EOC治疗效果却不尽人意,5年生存率仍徘徊于30%-40%,复发率超过60%,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。EOC已成为严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤。癌干细胞（cancer stem cell,CSC）是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、分化、无限增殖等干细胞特性的肿瘤细胞,是肿瘤发生发展的根源,与肿瘤的化疗耐药、转移侵袭以及复发密切相关。所以,探究EOC CSC的特性,寻找针对靶向CSC治疗EOC有效方法,是控制并根治卵巢癌的关键。近年来肿瘤免疫治疗受到高度关注,在基础研究和临床应用研究方面都取得了一些可喜的进展,而针对靶向CSC的免疫治疗目前主要倾向于:靶向CSC表型的免疫治疗、靶向CSC的T细胞过继免疫、靶向CSC的DC疫苗、靶向CSC憩室的免疫治疗、免疫检查点、CSC疫苗等,特别是疫苗研究,因其能激活机体的自然杀伤细胞（NK）和特异性细胞毒性T细胞（CTL）、产生抗肿瘤的保护性抗体等免疫应答,是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗方法。然而,由于肿瘤抗原免疫原性较弱、肿瘤的异质性、肿瘤免疫逃逸机制的复杂性等原因,尽管有众多的可喜研究报道,但肿瘤疫苗的实际疗效与预期效果仍有很大的差距,要作为治疗性肿瘤疫苗用于临床,仍有一些障碍需要克服,关键是如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫反应对瘤细胞免疫攻击。最新研究显示,CSC疫苗因其高表达优势抗原,可引发有效的靶向CSC免疫反应,达到抑制肿瘤生长和转移的效应,更引人关注。本课题组前期研究已发现,CD44+CD117+的EOC SKOV3/HO8910细胞具有CSC特性。因此,本研究将EOC CSC分离出来,采用简捷的工艺方法直接制备溶解完整的CSC疫苗,探究该疫苗抗卵巢癌效应及其机制。目的:探究EOC CSC疫苗在动物体内诱发抗肿瘤效应及其可能机制,为今后临床上使用该疫苗防治卵巢癌提供实验和理论依据。方法:1.通过免疫磁珠分选系统（MACS）从人EOC SKOV3/HO8910两种细胞系中分离出CD117+CD44+CSC,经反复冻融三次将其制备成CSC疫苗再接种到免疫缺陷的裸鼠体内（4×105CD117+CD44+CSC/鼠）,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用5×106个野生型SKOV3/HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。通过观察体内肿瘤生长及各免疫小鼠生存情况,初步评价SKOV3和HO8910 CSC疫苗的抗癌效果。通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠肿瘤细胞的CD117+CD44+亚群以及I型乙醛脱氢酶高表达(ALDH-1high)细胞群比例;此外,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠外周血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平,细胞杀伤实验测定NK细胞杀伤能力,实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blotting）检测小鼠肿瘤组织中颗粒酶和穿孔素以及NKG2D和MICA的表达水平,初步分析抗瘤效应及其分子机制。同时,经NOD/SCID鼠模型反向验证CSC疫苗的免疫效应。2.因受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（ROR1）分子可能是EOC CSC的一种优势抗原,在CSC疫苗激发机体免疫反应中具有重要作用。本研究分别设计针对ROR1基因序列短发夹RNA（shROR1）以及采用Gateway位点专一性重组方法,扩增ROR1序列,分别构建下调或上调ROR1的慢病毒重组质粒（pLV-shROR1或pLV-ovROR1）,进行慢病毒包装,利用倍比稀释法测定病毒滴度,再将含有pLV-shROR1和pLV-ovROR1慢病毒感染细胞,筛选出稳定表达ROR1的细胞克隆并扩大培养。用MACS分离出HO8910-pLV-shROR1 CD117+CD44+CSC（简称HO8910-shROR1 CSC）和HO8910-pLV-ovROR1CD117+CD44+CSC（HO8910-ovROR1 CSC）,用上述同样方法制备成疫苗后接种到免疫缺陷的裸鼠体内,再用5×106个野生型HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。经体内致瘤实验分别评价下调或上调ROR1的HO8910 CSC疫苗的抗癌效果;FCM、ELISA、NK杀伤实验、qRT-PCR、Western blotting等实验进一步分析优势抗原ROR1对HO8910 CSC疫苗抗瘤效应的影响。3.用无血清培养法（SFM）,筛选出鼠源性EOC细胞株ID8卵巢癌干样细胞（OCSC）,取2×105OCSC经反复冻融三次将其制备成疫苗,接种到C57BL/6小鼠体内,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用2×106个野生型ID8细胞皮下攻击免疫小鼠,观察免疫小鼠生存和肿瘤生长情况。继而构建下调ROR1的重组质粒,进行慢病毒包装并使用倍比稀释法测定病毒滴度,将含有pLV-shROR1的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,用qRT-PCR和Western bloting分析ID8细胞中ROR1分子下调表达情况。再用上述同样方法,在C57BL/6小鼠体内评价ID8-OCSC和ID8-OCSC-shROR1疫苗抗癌效果。采用FCM、ELISA、NK杀伤实验、CD4+T和CD8+T细胞杀伤实验、补体依赖的细胞毒活性（CDC）,qRT-PCR和Western blotting进一步分析疫苗诱发的免疫反应以及抗瘤效应与机制。此外,本研究还进行了用树突状细胞（DC）负载OCSC裂解物用于疫苗实验,试图比较两种方法制备的疫苗在诱导免疫鼠抗EOC效应是否有明显差异。结果:1.疫苗免疫鼠肿瘤体积大小、瘤体生长曲线及小鼠无瘤生存期显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能在无胸腺裸鼠体内中诱导免疫反应,体现在接种CD117+CD44+CSC疫苗的小鼠,与non-CD117+CD44+CSC疫苗组和SKOV3/HO8910细胞疫苗组及PBS组相比,肿瘤形成时间延迟、肿瘤体积较小、荷瘤鼠生存时间延长;血清中IFN-γ水平升高,TGF-β水平降低,且具有较强的NK杀伤活性。这些结果与不同对照组相比,差异有显着性意义（p（27）0.05）。另外,qRT-PCR结果显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中,具有更高水平的穿孔素和颗粒酶表达;同时,qRT-PCR和Western blotting结果显示,肿瘤组织中具有高水平的NKG2D和MIC A表达（p（27）0.05）。此外,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能够显着地减少小鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC细胞群以及ALDH-1high细胞群比例。结果提示:SKOV3/HO8910CSC疫苗能靶向杀伤EOC CSC,抑制裸鼠体内肿瘤生长;而在NOD/SCID鼠模型因其T和B淋巴细胞严重缺乏,却没有明显抑瘤效应,从而反向证明了CSC疫苗的抗瘤效应是因其诱发免疫效应所致。2.分别筛选出感染pLV-shROR1的HO8910-pLV-shROR1细胞（简称HO8910-shROR1）和过表达ROR1分子的HO8910-pLV-ROR1细胞（简称HO8910-ovROR1）。qRT-PCR和Western blotting分析显示,ROR1分子分别被有效地下调和上调,表明从基因和蛋白水平证实,在HO8910细胞调控ROR1表达成功。HO8910-shROR1或HO8910-ovROR1细胞扩大培养后,经MACS分选出CD117+CD44+CSC,制备疫苗免疫裸鼠结果显示,HO8910-shROR1和HO8910-ovROR1以及HO8910三组CD117+CD44+CSC疫苗,在免疫鼠激发的抗HO8910卵巢癌效应中,HO8910-ovROR1 CSC疫苗抗瘤效果最强,小鼠肿瘤生长最慢,体积最小,无瘤生存期最长,HO8910 CSC疫苗次之（p（27）0.05）,HO8910-shROR1疫苗最低（p（27）0.05）。ROR1高表达的HO8910-ovROR1 CSC疫苗免疫鼠,在三组疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ和抗ROR1水平最高,而TGF-β水平最低;同时,NK杀伤能力也最强。qRT-PCR结果显示HO8910-ovROR1 CSC疫苗组,小鼠肿瘤组织中含有较高水平的颗粒酶和穿孔素,qRT-PCR和Western blotting显示,表达高水平NKG2D和MIC A（p（27）0.05）。此外,以HO8910-ovROR1 CSC为基础的疫苗能够更明显地下调裸鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC亚群以及ALDHhigh细胞群的比例。以上结果证实:ROR1分子可能是EOC CSC疫苗的优势抗原,在HO8910 CSC疫苗中发挥关键的免疫原性作用。3.ID8-OCSC疫苗在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤实验结果显示,从肿瘤生长速度、肿瘤大小以及无瘤生存期显示方面,明显优于非ID8-OCSC疫苗组,差异有统计学意义（p<0.05）。将ROR1分子下调后,ID8-OCSC-shROR1疫苗组小鼠的抗肿瘤效应显着弱于ID8-OCSC疫苗组（p<0.05）,且NK细胞和脾细胞杀伤能力、抗体水平、CDC活性、血清IFN-γ水平等均显着下降（p<0.05）,但TGF-β水平则升高（p（27）0.05）。对ID8-OCSC疫苗激发免疫鼠脾脏T细胞功能检测显示,分离的CD4+T和CD8+T细胞对靶细胞杀伤实验与与ID8-OCSC-shROR1疫苗相相比,ID8-OCSC疫苗免疫鼠的CD4+T和CD8+T杀伤能力最强,特别是CD8+T的杀伤能力更为明显。qRT-PCR分析显示,ID8-OCSC疫苗组瘤组织中颗粒酶和穿孔素分子表达高于ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组;同时,NKG2D和MIC A的水平也高于其他对照组,差异有显着性意义（p（27）0.05）。此外,FCM分析肿瘤组织中ALDHhigh细胞群比例明显减少,而ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组依次增高,提示ID8-OCSC疫苗能诱导免疫鼠靶向杀伤OCSC。该结果不仅说明ID8 OCSC疫苗有较强的抗肿瘤免疫效应,而且进一步证实ROR1分子可能是ID8 OCSC疫苗的优势抗原,当其下调后,在C57BL/6小鼠诱发抗肿瘤免疫效应也随之减弱。此外,反复冻融OCSC制备的疫苗与反复冻融OCSC负载DC制备的疫苗诱导小鼠的抗EOC效应相似,虽略有差异,但无统计学意义。结论:1.人源性EOC SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能诱导免疫鼠产生抗肿瘤效应,拮抗卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关,下调或上调ROR1分子表达,可影响CSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。2.鼠源性ID8 OCSC疫苗能诱发C57BL/6免疫鼠产生免疫效应而抑制卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原相关,下调ROR1分子表达,可影响ID8 OCSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。3.本研究制备的EOC CSC疫苗有效地增强免疫鼠产生抗肿瘤效应,这为临床上应用CSC疫苗免疫防治EOC提供了科学的实验依据。
陈宏[10]（2019）在《铂（Ⅳ）配合物与基于蛋白靶向降解的抗肿瘤化合物研究》文中研究说明本论文设计合成并研究了两类抗肿瘤化合物,即铂（Ⅳ）抗肿瘤配合物以及具有蛋白靶向降解功能的抗肿瘤化合物。第一部分:铂类药物是临床中最常见的化疗药物,开发毒副作用小、能克服顺铂耐药的新型铂配合物是铂类药物研发的目标。铂（Ⅳ）配合物因具有不同于铂（II）配合物的化学及生物学性质,已经成为新一代铂类抗肿瘤药物的研究热点。鉴于糖酵解抑制剂氯尼达明（LND）可以提高铂类药物的抗肿瘤活性,我们将LND偶联到铂（Ⅳ）配合物的轴向上合成了一系列铂（Ⅳ）抗肿瘤前药。其中,化合物2-1对LNCaP细胞具有优于顺铂的抗肿瘤活性,它能被抗坏血酸（VC）还原为铂（II）活性组分并释放出LND片段。在化合物2-1的作用下,肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平升高,线粒体膜电位降低,并最终发生凋亡。肿瘤细胞中谷胱甘肽巯基转移酶（GSTs）活性的升高与铂类药物耐药性以及毒副作用的产生密切相关。因此,我们将GSTs抑制剂NBDHEX偶联到铂（Ⅳ）配合物的轴向上合成了一系列铂（Ⅳ）抗肿瘤前药。研究发现,轴向上含有一个羟基和一分子NBDHEX的化合物3-2具有优异的体内外抗肿瘤活性,且毒副作用小。它能通过抑制GSTs的活性来提高肿瘤细胞的铂摄取,对DNA造成严重损伤,并克服肿瘤细胞的顺铂耐药。抗肿瘤机制研究表明,化合物3-2能够通过内源性凋亡通路诱导骨肉瘤U2OS细胞、非小细胞肺癌A549和A549/DDP细胞发生凋亡,而且还能抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。第二部分:蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）是一种双功能化学偶联物,它能依靠泛素-蛋白酶体系统（UPS）促进目标蛋白降解。由于具有不同于传统小分子抑制剂的作用机制,PROTAC已经成为目前抗肿瘤药研究的全新方向。蛋白激酶2（CK2）在细胞的生存和增殖过程中发挥重要作用,其表达水平的升高与肿瘤的生成和恶化密切相关。我们以泊马度胺作为E3泛素连接酶募集配体,通过点击反应将其与CK2抑制剂CX-4945偶联到一起,合成了一系列靶向CK2蛋白的PROTACs。其中,化合物5-2具有不同于CX-4945的作用机制,它能以UPS依赖的方式促进CK2蛋白降解,进而抑制Akt的磷酸化并上调肿瘤抑制因子p53的表达水平。化合物5-2能迅速地诱导高表达CK2蛋白的MDAMB-231细胞发生凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期。作为肿瘤细胞生长信号的第一转导分子,B-Raf激酶一直都是抗肿瘤药物研究的热门靶点。我们将泊马度胺与小分子Rigosertib偶联到一起,合成了一系列具有B-Raf蛋白降解功能的抗肿瘤化合物。其中,化合物6-2对高表达B-Raf蛋白的MCF-7细胞的抗肿瘤活性优于阳性对照化合物,它能以UPS依赖的方式促进B-Raf蛋白降解,进而下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达水平,最终引起细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期。
二、骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究（论文提纲范文）
（1）黄芪活性多糖APS-Ⅱ三氟乙酸降解寡糖片段的免疫活性筛选与结构初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 立题背景及意义 |
| 1.2 研究内容、技术路线图及创新点 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 技术路线图 |
| 1.2.3 创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 糖类的研究 |
| 2.1.1 多糖的研究现状 |
| 2.1.2 寡糖的基本概述 |
| 2.1.3 寡糖的研究成果 |
| 2.2 多糖的降解方法 |
| 2.2.1 化学降解 |
| 2.2.2 生物降解 |
| 2.2.3 物理降解 |
| 2.3 寡糖的分离制备 |
| 2.3.1 制备液相分离制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶柱分离制备 |
| 2.3.3 膜分离制备 |
| 2.4 寡糖的结构解析方法 |
| 2.4.1 寡糖的液相表征分析 |
| 2.4.2 寡糖的高效液相色谱质谱联用分析 |
| 2.4.3 寡糖的气相色谱质谱联用分析 |
| 2.4.4 寡糖的红外检测 |
| 2.4.5 寡糖的核磁测定 |
| 2.5 寡糖的生物活性 |
| 2.5.1 促进免疫功能 |
| 2.5.2 抗抑郁作用 |
| 2.5.3 降低血糖 |
| 2.5.4 保护心肌受损 |
| 2.5.5 调节菌群比例 |
| 2.5.6 其他作用 |
| 第三章 黄芪免疫活性多糖的三氟乙酸水解 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料试剂和仪器 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 黄芪免疫活性多糖的制备 |
| 3.3.2 黄芪免疫活性多糖酸水解的单因素考察 |
| 3.3.3 黄芪免疫活性多糖酸水解的L_9(3~3)正交试验 |
| 3.3.4 酸水解的重复性实验 |
| 3.3.5 酸水解的稳定性实验 |
| 3.3.6 黄芪混寡糖的批量制备 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 黄芪免疫活性多糖的液相表征 |
| 3.4.2 黄芪免疫活性多糖酸水解的单因素实验结果 |
| 3.4.3 黄芪免疫活性多糖酸水解的最优条件分析 |
| 3.4.4 酸水解的重复性评价 |
| 3.4.5 酸水解的稳定性评价 |
| 3.4.6 黄芪混寡糖的产率 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黄芪免疫活性多糖降解寡糖的分离制备及结构解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料试剂和仪器 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 黄芪混寡糖的质谱检测 |
| 4.3.2 不同寡糖片段的分离制备 |
| 4.3.3 不同寡糖片段的单糖组成测定 |
| 4.3.4 不同寡糖片段的红外测定 |
| 4.3.5 不同寡糖片段的甲基化分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 黄芪混寡糖的质谱分析 |
| 4.4.2 不同寡糖片段的制备及液相表征 |
| 4.4.3 不同寡糖片段的单糖组成分析 |
| 4.4.4 不同寡糖片段的红外分析 |
| 4.4.5 不同寡糖片段的甲基化分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于体外免疫细胞的黄芪免疫活性多糖中活性寡糖片段的筛选 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料试剂和仪器 |
| 5.2.1 研究对象 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验内容 |
| 5.3.1 不同聚合度寡糖片段的固有免疫 |
| 5.3.1.1 对巨噬细胞的吞噬活性测定 |
| 5.3.1.2 对自然杀伤细胞的细胞毒性测定 |
| 5.3.2 不同聚合度寡糖片段的特异性免疫 |
| 5.3.2.1 对刀豆蛋白A诱导的T淋巴细胞的影响 |
| 5.3.2.2 对脂多糖诱导的B淋巴细胞的影响 |
| 5.3.2.3 对脂多糖诱导的脾淋巴细胞分泌Ig G的影响 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 不同寡糖片段的对巨噬细胞的吞噬活性 |
| 5.4.2 不同寡糖片段对自然杀伤细胞的杀伤活性 |
| 5.4.3 不同寡糖片段对T淋巴细胞的影响 |
| 5.4.4 不同寡糖片段对B淋巴细胞的影响 |
| 5.4.5 不同寡糖片段对脾淋巴细胞分泌Ig G的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 研究工作总结 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 学习心得 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（2）CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.骨肉瘤及其治疗现状 |
| 1.1 骨肉瘤的危害 |
| 1.2 骨肉瘤的免疫微环境 |
| 1.3 骨肉瘤的免疫治疗概况 |
| 2.NK G2D配体在骨肉瘤中的表达 |
| 3.趋化因子CXCL13与CXCR5 在肿瘤中的作用 |
| 4.肿瘤微环境 |
| 4.1 肿瘤浸润的MDSCs细胞 |
| 4.2 肿瘤浸润的巨噬细胞 |
| 4.3 肿瘤浸润的Tregs细胞 |
| 5.嵌合抗原受体T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 5.1 CAR-T概述 |
| 5.2 嵌合抗原受体的结构 |
| 5.3 CAR-T细胞治疗研究进展 |
| 6.NFAT信号通路及其作用机制 |
| 第二章 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 CXCL13 与骨肉瘤的关系 |
| 2.3 Mock-CAR、NKG2D-CAR、CXCR5-NKG2D-CAR的构建和T细胞的感染 |
| 2.4 CAR-T细胞的制备 |
| 2.5 CAR-T细胞体外活性研究 |
| 2.6 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞机制研究 |
| 2.7 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤体内研究 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CXCL13 的表达量与骨肉瘤病人免疫和生存期的关系 |
| 3.2 Mock、NKG2D、CXCR5-NKG2D CAR表达载体、病毒包装和T细胞的感染 |
| 3.3 Mock-CAR-T、NKG2D-CAR-T和 CXCR5-NKG2D-CAR-T体外活性 |
| 3.4 CXCR5增强NKG2D-CAR-T细胞活性的机制研究 |
| 3.5 CXCR5 增强了NKG2D-CAR-T的体内抗肿瘤活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 mCXCR5-NKG2D-CAR-T对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外活性研究 |
| 2.4 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对BALB/c骨肉瘤小鼠的治疗 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鼠源CAR-T细胞和鼠源靶细胞的制备 |
| 3.2 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞体外活性检测 |
| 3.3 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体内活性检测 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 已发表文章 |
| 发表专利 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件一 RNA测序后定量PCR引物序列 |
（3）诱导免疫原性细胞死亡的铂（Ⅳ）配合物合成及生物活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的化学免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤微环境 |
| 1.1.2 化学治疗与免疫治疗 |
| 1.1.3 化学免疫治疗的研究现状 |
| 1.1.4 铂类药物在化学免疫治疗中的应用进展 |
| 1.1.4.1 铂(Ⅱ)配合物 |
| 1.1.4.2 铂(Ⅳ)配合物 |
| 1.2 免疫原性细胞死亡(ICD) |
| 1.2.1 ICD的定义 |
| 1.2.2 ICD的分子机制和损伤相关分子模式 |
| 1.2.3 常见化疗药物中的ICD诱导剂 |
| 1.2.4 铂类ICD诱导剂 |
| 1.2.5 新型铂类ICD诱导剂的开发 |
| 1.3 本研究的意义及目标 |
| 参考文献 |
| 第2章 诱导免疫原性细胞死亡的铂(Ⅳ)配合物合成及生物活性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 合成与表征 |
| 2.2.2.1 Oxoplatin的合成 |
| 2.2.2.2 CPS-COOH的合成 |
| 2.2.2.3 DCP的合成 |
| 2.2.3 配合物还原性测试 |
| 2.2.4 与DNA相互作用 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 体外细胞毒活性 |
| 2.2.7 细胞凋亡 |
| 2.2.8 细胞内铂元素的含量 |
| 2.2.9 肿瘤细胞表面CRT的表达 |
| 2.2.10 HMGB1 释放检测 |
| 2.2.11 ATP分泌检测 |
| 2.2.12 内质网应激相关蛋白e IF2α的磷酸化分析 |
| 2.2.13 细胞内活性氧测试 |
| 2.2.14 INF-γ和TNF-α的细胞外水平 |
| 2.2.15 PBMC对肿瘤细胞的毒性 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 合成与表征 |
| 2.3.2 配合物还原性测试 |
| 2.3.3 与DNA相互作用 |
| 2.3.4 体外细胞毒活性 |
| 2.3.5 细胞凋亡 |
| 2.3.6 细胞内铂元素的含量 |
| 2.3.7 肿瘤细胞表面CRT的表达 |
| 2.3.8 HMGB1 释放和ATP分泌检测 |
| 2.3.9 内质网应激相关蛋白eIF2α的磷酸化分析 |
| 2.3.10 细胞内活性氧测试 |
| 2.3.11 INF-γ和TNF-α的细胞外水平 |
| 2.3.12 PBMC对肿瘤细胞的毒性 |
| 2.4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一: T细胞淋巴瘤的治疗现状及进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二: 复方苦参注射液抗肿瘤作用及其机制实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验三 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第三部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响 |
| 方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第四部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第五部分 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型体内实验研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（5）丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩写词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤的现状 |
| 1.2 过继细胞治疗 |
| 1.3 γδ T细胞 |
| 1.4 唑来膦酸 |
| 1.5 丙戊酸钠 |
| 2 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系及其机制探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 丙戊酸钠联合唑来磷酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系 |
| 2.4 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞机制 |
| 2.5 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同阻断甲羟戊酸通路促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞 |
| 2.6 讨论与小结 |
| 3 丙戊酸钠联合唑来膦酸促进γδ T细胞杀伤原代骨肉瘤细胞效应研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 丙戊酸钠联合唑来膦酸致敏γδ T细胞体内抑制骨肉瘤增殖的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及研究生期间科研情况 |
（6）免疫检查点分子TIM-3在肿瘤免疫中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TIM-3在肿瘤微环境中的表达及靶向TIM-3抗肿瘤作用机制 |
| 一.材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 二.结果 |
| 1.TIM-3在肿瘤浸润免疫细胞亚群中差异表达 |
| 2.TIM-3~+的T细胞群体高表达活化标志分子 |
| 3.TIM-3~+的细胞群体为高度活化的效应细胞 |
| 4.TIM-3抗体与PD-1抗体联合使用在多种肿瘤模型中有良好的治疗效果 |
| 5.TIM-3抗体与PD-1抗体联合作用增强抗肿瘤免疫应答 |
| 6.LAG-3的上调表达介导肿瘤对TIM-3/PD-1抗体联合治疗的耐药性 |
| 7.TIM-3/PD-1/LAG-3三抗体联合治疗进一步增强CD8~+T细胞细胞毒作用 |
| 三.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人源化TIM-3单克隆抗体的功能作用研究 |
| 一.材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 二.结果 |
| 1.筛选TIM-3单克隆杂交瘤细胞株 |
| 2.纯化的人源化TIM-3抗体亲和性验证 |
| 3.TIM-3单克隆抗体可以有效阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)的结合 |
| 4.candidate 1能够增强T细胞体外效应功能 |
| 5.candidate 1与nivolumab协同发挥抗肿瘤作用 |
| 三.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TIM-3在调节性T细胞上的功能作用研究 |
| 一.材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 二.结果 |
| 1.头颈鳞状细胞癌中TIM-3标记活化的Treg细胞群体 |
| 2.构建Treg条件型敲除TIM-3小鼠 |
| 3.Treg条件型敲除TIM-3表达的小鼠中MC38肿瘤生长受到抑制 |
| 4.TIM-3在Treg中的缺失导致肿瘤免疫抑制微环境的逆转 |
| 5.TIM-3在Treg中的缺失导致其抑制功能下降 |
| 三.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 综述一 TIM-3作为肿瘤免疫治疗靶点的作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 肿瘤浸润CD8~+ T淋巴细胞的功能缺失分子机制 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 本课题所受资助 |
| 致谢 |
（7）DNA甲基化调控CXCL12在介导骨肉瘤进展和免疫应答中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 第一部分 CXCL12-CXCR4 生物轴在骨肉瘤中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.4 讨论与分析 |
| 1.5 小结与展望 |
| 第二部分 CXCL12–CXCR4 轴与骨肉瘤内淋巴细胞、临床预后的相关性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 小结与展望 |
| 第三部分 DNA甲基化调控CXCL12 在介导骨肉瘤进展和免疫应答中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.5 小结与展望 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 T 细胞治疗骨肉瘤的挑战与机遇 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（8）唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验细胞 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.1.1 细胞复苏 |
| 2.5.1.2 细胞传代 |
| 2.5.1.3 细胞冻存 |
| 2.5.1.3.1 配制冻存液 |
| 2.5.1.3.2 消化收取细胞 |
| 2.5.1.3.3 进行冻存 |
| 2.5.2 采用MTT法检测骨肉瘤MG-63 细胞活力变化 |
| 2.5.2.1 MTT法 |
| 2.5.2.2 MTT配制方法 |
| 2.5.2.3 磷酸缓冲液(PBS)配制 |
| 2.5.2.4 贴壁细胞MTT法 |
| 2.5.2.5 MTT注意事项 |
| 2.5.3 划痕实验观察骨肉瘤MG-63 细胞的迁移能力、凋亡改变 |
| 2.5.4 透射电镜观察骨肉瘤MG-63 细胞在100μM唑来膦酸作用48h后细胞凋亡改变 |
| 2.5.4.1 透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)的原理 |
| 2.5.4.2 取材 |
| 2.5.4.3 固定 |
| 2.5.4.4 脱水 |
| 2.5.4.5 浸透 |
| 2.5.4.6 包埋和聚合 |
| 2.5.4.7 超薄切片 |
| 2.5.4.8 染色 |
| 2.5.5 流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2OS细胞在100μM唑来膦酸作用48 h后,细胞的凋亡变化 |
| 2.5.5.1 流式细胞技术(flow cytometry,FCM) |
| 2.5.5.2 流式实施步骤 |
| 2.5.5.3 流式注意事项 |
| 2.5.6 蛋白印迹方法Western Blot(WB)检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸作用后,对AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路的影响 |
| 2.5.6.1 蛋白印迹方法原理 |
| 2.5.6.2 WB实验分组 |
| 2.5.6.3 收集细胞蛋白 |
| 2.5.6.4 测定蛋白浓度 |
| 2.5.6.5 电泳 |
| 2.5.6.6 转膜 |
| 2.5.6.7 抗体杂交 |
| 2.5.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 唑来膦酸(ZOL)抑制骨肉瘤MG-63 细胞增殖和细胞迁移 |
| 3.2 唑来膦酸通过抑制AKT/GSK-3β通路作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞 |
| 3.3 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.1 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63 细胞的增殖 |
| 3.3.2 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡 |
| 3.4 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对Wnt/β-Catenin通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究的创新点和意义 |
| 三、参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 人源性卵巢癌干细胞疫苗的抗肿瘤效应及机制 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章 人源性卵巢癌干细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 鼠源性卵巢癌干样细胞疫苗机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）铂（Ⅳ）配合物与基于蛋白靶向降解的抗肿瘤化合物研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词注释表 |
| 第一部分 铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物的研究 |
| 第一章 铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物简介 |
| 1.2.1 化学结构与性质 |
| 1.2.2 抗肿瘤作用机制 |
| 1.3 研究现状 |
| 1.3.1 简单的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.2 脂溶性铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.3 作用于肿瘤微环境的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.4 靶向细胞表面受体的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.5 作用于细胞器的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.6 具有多个分子靶点的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.3.7 其它类型的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.4 选题依据 |
| 1.4.1 偶联氯尼达明的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 1.4.2 具有GSTs抑制功能的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物 |
| 参考文献 |
| 第二章 偶联氯尼达明的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 化合物的设计、合成与表征 |
| 2.2.1 化合物的设计 |
| 2.2.2 氯尼达明的合成 |
| 2.2.3 铂(Ⅳ)配合物前体的合成 |
| 2.2.4 铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物的合成与表征 |
| 2.3 体外生物活性及理化性质研究 |
| 2.3.1 体外抗肿瘤活性 |
| 2.3.2 代表性化合物克服顺铂耐药的能力 |
| 2.3.3 代表性化合物的稳定性和还原行为研究 |
| 2.4 代表性化合物抗肿瘤作用机制初步研究 |
| 2.4.1 细胞凋亡 |
| 2.4.2 细胞周期 |
| 2.4.3 铂摄取 |
| 2.4.4 线粒体膜电位 |
| 2.4.5 活性氧水平 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 具有GSTs抑制功能的铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 化合物的设计、合成与表征 |
| 3.2.1 化合物的设计 |
| 3.2.2 NBDHEX及其衍生物的合成 |
| 3.2.3 铂(Ⅳ)配合物前体的合成 |
| 3.2.4 铂(Ⅳ)抗肿瘤配合物的合成与表征 |
| 3.3 体外生物活性及理化性质研究 |
| 3.3.1 体外抗肿瘤活性 |
| 3.3.2 克服顺铂耐药的能力 |
| 3.3.3 稳定性和还原行为 |
| 3.3.4 GSTs抑制能力 |
| 3.4 代表性化合物对骨肉瘤的抗肿瘤机制及体内活性研究 |
| 3.4.1 细胞凋亡 |
| 3.4.2 细胞周期 |
| 3.4.3 铂摄取 |
| 3.4.4 彗星实验 |
| 3.4.5 抗迁移和侵袭能力 |
| 3.4.6 蛋白质免疫印迹 |
| 3.4.7 体内活性 |
| 3.5 代表性化合物克服肺癌顺铂耐药的机制及体内活性研究 |
| 3.5.1 细胞凋亡 |
| 3.5.2 细胞周期 |
| 3.5.3 铂摄取和DNA铂化 |
| 3.5.4 彗星实验 |
| 3.5.5 蛋白质免疫印迹 |
| 3.5.6 体内活性 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于蛋白靶向降解的抗肿瘤化合物研究 |
| 第四章 蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)的研究进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 PROTAC简介 |
| 4.2.1 作用基础 |
| 4.2.2 结构与作用机制 |
| 4.3 PROTAC的研究现状 |
| 4.3.1 早期的PROTAC |
| 4.3.2 基于E3s-MDM2的小分子PROTAC |
| 4.3.3 基于E3s-IAP的小分子PROTAC |
| 4.3.4 基于E3s-VHL的小分子PROTAC |
| 4.3.5 基于E3s-CRBN的小分子PROTAC |
| 4.4 选题依据 |
| 4.4.1 泊马度胺作为E3泛素连接酶配体 |
| 4.4.2 CK2和B-Raf蛋白激酶的靶向降解 |
| 参考文献 |
| 第五章 靶向降解CK2蛋白的化合物研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 化合物的设计、合成与表征 |
| 5.2.1 化合物的设计 |
| 5.2.2 泊马度胺及其衍生物的合成 |
| 5.2.3 CX-4945及其衍生物的合成 |
| 5.2.4 目标化合物的合成与表征 |
| 5.3 生物及化学性质研究 |
| 5.3.1 化合物对CK2蛋白激酶的抑制能力 |
| 5.3.2 不同细胞株CK2蛋白表达水平分析 |
| 5.3.3 化合物促进CK2蛋白降解 |
| 5.3.4 CK2蛋白降解的机制 |
| 5.3.5 CK2蛋白发生降解对下游蛋白的影响 |
| 5.3.6 代表性化合物的稳定性 |
| 5.4 体外抗肿瘤作用研究 |
| 5.4.1 体外抗肿瘤活性 |
| 5.4.2 细胞凋亡 |
| 5.4.3 细胞周期 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 具有B-Raf蛋白降解功能的化合物研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 化合物的设计、合成与表征 |
| 6.2.1 化合物的设计 |
| 6.2.2 泊马度胺及其衍生物的合成 |
| 6.2.3 RGS及其衍生物的合成 |
| 6.2.4 目标化合物的合成与表征 |
| 6.3 体外抗肿瘤作用研究 |
| 6.3.1 体外抗肿瘤活性 |
| 6.3.2 细胞凋亡 |
| 6.3.3 细胞周期 |
| 6.4 代表性化合物的抗肿瘤机制初探 |
| 6.4.1 不同细胞株B-Raf蛋白表达水平分析 |
| 6.4.2 代表性化合物促进B-Raf蛋白降解 |
| 6.4.3 代表性化合物促进B-Raf蛋白降解的机制 |
| 6.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表论文题录 |
| 致谢 |
| 附录一 实验试剂与仪器 |
| 附录二 目标化合物的结构表征谱图 |
四、骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究（论文参考文献）
- [1]黄芪活性多糖APS-Ⅱ三氟乙酸降解寡糖片段的免疫活性筛选与结构初探[D]. 石丽霞. 山西大学, 2021
- [2]CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究[D]. 张利. 华东师范大学, 2021(12)
- [3]诱导免疫原性细胞死亡的铂（Ⅳ）配合物合成及生物活性研究[D]. 孙悦文. 南京大学, 2020(12)
- [4]复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究[D]. 郑佳彬. 中国中医科学院, 2020(01)
- [5]丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应[D]. 王盛东. 浙江大学, 2020(01)
- [6]免疫检查点分子TIM-3在肿瘤免疫中的作用及机制[D]. 杨敏. 苏州大学, 2020
- [7]DNA甲基化调控CXCL12在介导骨肉瘤进展和免疫应答中的作用[D]. 王战. 浙江大学, 2020(01)
- [8]唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用[D]. 李胜. 中国医科大学, 2019(04)
- [9]卵巢癌干细胞疫苗抗卵巢癌疗效及机制研究[D]. 吴迪. 东南大学, 2019(05)
- [10]铂（Ⅳ）配合物与基于蛋白靶向降解的抗肿瘤化合物研究[D]. 陈宏. 东南大学, 2019(06)