一、重组血管生成抑制因子r-K4K5的分离纯化与功能鉴定（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中指出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
张椰莉[2]（2020）在《人层粘连蛋白α3链LG1结构域是人纤溶酶原Kringle5在内皮细胞表面的一个受体》文中认为已知人纤溶酶原Kringle 5通过诱导内皮细胞凋亡而具有更强的抗血管生成作用,是一种新型的新生血管抑制剂,在肿瘤治疗以及其它与血管增生有关的疾病治疗方面具有潜在临床价值和广阔的应用前景。但目前,对于Kringle 5的体内结合受体以及Kringle 5与其体内受体之间的结合机理研究甚少。前期实验室已经用Ph.D.-7噬菌体展示肽库和酶联免疫吸附法筛选和验证与Kringle 5有亲和力的短肽序列（IGNSNTL）。基于此,我们通过BLAST工具对Kringle 5受体进行搜索,以E值、匹配程度和结构域功能等原则进行筛选,然后以ligand blot、前沿色谱、细胞功能实验和分子动力学模拟进行验证,并进一步揭示Kringle 5与其受体分子之间的作用机理,为基于Kringle5受体新型药物的筛选和研发奠定一定的基础。（1）以短肽序列（IGNSNTL）为模板,采用BLAST工具进行搜索比对,按照序列匹配程度、序列是否在功能区和E值等原则进行筛选,初步确定层粘连蛋白α3链是Kringle 5在体内的可能受体,且其LG1结构域与Kringle 5之间存在相互作用;采用Easymodeller 4.0软件成功构建LG1的三维结构,并通过分子动力学技术进行进一步优化和SAVES在线评估。结果表明所得LG1构型的骨架、空间结构和能量是合理的。（2）在成功克隆、表达和分离纯化Kringle 5和LG1的基础上,生物素标记Kringle5,以BSA作为对照,通过ligand blot实验,直观的揭示了Kringle 5与LG1之间存在特异性相互作用。在成功构建固定化Kringle 5色谱柱的基础上,通过前沿分析得出Kringle 5与LG1之间存在剂量依赖关系,结合常数Ka为4.3×105 L/mol,并且所有突破时间都与LG1浓度呈现负相关;Kringle 5以单层吸附的方式固定在硅胶的表面,该固定相与LGI之间只存在一种类型的结合位点。（3）通过不同浓度的重组Kringle 5对内皮细胞的增殖和凋亡实验表明,Kringle 5对内皮细胞有效抑制浓度IC50为250 nM,且内皮细胞是被Kringle 5以剂量依赖的方式诱导凋亡,表明内皮细胞与Kringle 5结合后一定激发了细胞的凋亡信号,导致细胞死亡。重组Kringle 5与层粘连蛋白结合后对细胞的增殖和凋亡实验表明,层粘连蛋白α3抗体可以阻止Kringle 5与层粘连蛋白α3的结合,进而阻断了Kringle 5诱导细胞凋亡和抑制增殖的过程,说明层粘连蛋白α3参与这些过程,是Kringle 5在内皮细胞表面的一个受体。（4）采用分子对接和分子动力学模拟Kringle 5和LG1之间的相互作用过程。?G为负值,说明它们可以自发结合,且静电力为主要驱动力。在结合过程中Kringle 5中Arg10和Pro83贡献较大,在分别突变后,原本由Arg10贡献的静电力减少55.7%,由Pro83贡献的极性自由能增加71.7%,均不利于结合,表明在结合过程中Arg10和Pro83为关键氨基酸残基。（5）此外,通过分子动力学模拟得知LG1在与Kringle 5结合过程中,loop1、loop2、coil1、coil2和coil4发生波动,coil3（140-143）由无规则卷曲变α为螺旋,α1螺旋（148-153）变为规则卷曲,说明在相互作用时发生诱导契合过程。同时这些波动均位于β片层的边缘,类似于其他LG结构域中的Ca2+结合位点。上述研究,不仅理论预测和实验验证了LG1结构域是Kringle 5在内皮细胞表面的一个受体,而且为Kringle 5及其特异性受体的结合机理提供了新的视角,并且也为针对病理性血管生成的新型药物开发提供了重要参考。
韦范[3]（2020）在《红麻蛋白乙酰化修饰调控细胞质雄性不育及相关功能研究》文中研究指明蛋白质赖氨酸乙酰化修饰（lysin acetylation,Kac）是一种普遍存在的可逆的蛋白质翻译后修饰（Post-translational modification,PTM）。研究表明,PTM可调控基因表达,参与花粉发育,最终影响植物育性。红麻具有较强的杂种优势,细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility,CMS）是其杂种优势利用的主要途径。目前还未见关于蛋白乙酰化修饰调控红麻细胞质雄性不育发生或者调控花药和花粉发育的报道。因此,本研究以红麻CMS系UG93A及其保持系UG93B花药为研究材料,对花药的乙酰化修饰蛋白质组进行研究,鉴定与红麻CMS相关的乙酰化修饰差异蛋白及其参与调控红麻花粉发育（败育）的代谢途径;分析乙酰化修饰对关键蛋白的影响;同时对红麻组蛋白的乙酰化开展研究,克隆鉴定组蛋白去乙酰化酶家族基因,分析其亚细胞定位及基因表达模式;并对组蛋白去乙酰化酶Hc HDA19的生物学功能进行研究,以期更好地理解红麻蛋白质乙酰化共价修饰的调控机制。研究结果对于揭示红麻细胞质雄性不育发生过程中的乙酰化调控机制具有重要意义;同时可以拓展我们对蛋白乙酰化修饰在花粉发育过程中的调控作用的认识。本研究获得的主要研究结果和结论如下:1.利用laber-free LC MS/MS技术对红麻CMS系UG93A及其保持系UG93B双核期花药进行乙酰化蛋白质组学分析。结果表明,在UG93A和UG93B花药中总计鉴定到672个蛋白上的1204个赖氨酸乙酰化修饰位点。UG93A和UG93B之间共有56个乙酰化修饰差异蛋白（|Fold change|≥2,P-value<0.05）,其中,92%的乙酰化差异蛋白位于细胞质中,其余8%定位于细胞核中。这些乙酰化差异蛋白主要富集于代谢酶活性、转移酶活性以及结合调控等功能类型,大多参与糖酵解/糖异生、柠檬酸循环（TCA）、碳代谢、氧化磷酸化（OXPHOS）和氨基酸生物合成等物质与能量代谢过程,与花药和花粉发育密切相关,这56个差异蛋白可能参与调控红麻细胞质雄性不育的发生。2.能量代谢在花药和花粉发育中起着重要作用,与植物的育性密切相关。我们选取能量代谢关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）来研究乙酰化修饰对蛋白活性的影响。UG93A中GAPDH蛋白第188位点的赖氨酸乙酰化修饰水平较UG93B下调了2.24倍,我们通过点突变将该位点编码的赖氨酸突变为精氨酸后,构建p PIC9k载体对突变前后的GAPDH进行酵母表达重组蛋白,酶活性检测发现K188位点的乙酰化正向调控GAPDH的酶活力,该位点乙酰化修饰水平下降导致GAPDH的酶活力降低,影响能量代谢过程,能量供应不足可能引起红麻雄性不育的发生。Pull-down和Bi FC实验证明组蛋白去乙酰化酶SRT2重组蛋白与GAPDH重组蛋白存在互作。SRT2可催化GAPDH发生去乙酰化反应,GAPDH整体乙酰化修饰水平负调控其酶活力,表明乙酰化修饰对酶的活性产生重要影响。3.组蛋白的乙酰化修饰参与染色质结构重塑进而对基因的表达起调控作用。红麻花药乙酰化蛋白质组学分析共鉴定了17个组蛋白乙酰化修饰位点。利用H3K9ac、H3K27ac和H4K5ac组蛋白特异性位点的乙酰化修饰抗体对UG93A和UG93B双核期花药的组蛋白进行Western Blot检测,结果显示这3个组蛋白位点的乙酰化修饰水平在UG93A和UG93B间存在差异,表明H3K9、H3K27和H4K5的乙酰化修饰参与调控了红麻细胞质雄性不育的发生。4.克隆鉴定了6个红麻组蛋白去乙酰化酶基因,并对其进行生物信息学、时空表达以及亚细胞定位分析。结果发现,这6个Hc HDACs基因在UG93A及UG93B的根、茎、叶以及花药组织中都表达,表明它们广泛参与了红麻的生长发育过程。在花药发育的单核期及双核期,Hc HDA19在不育系中的表达量均显着高于保持系。亚细胞定位结果显示Hc HDA2和Hc HDA8定位在细胞核,Hc HDA6和Hc HDA19定位于细胞核与细胞质,Hc HDA9主要集中在细胞核与细胞膜,不同的亚细胞定位暗示着它们不同的生物学功能。5.构建了红麻组蛋白去乙酰化酶基因Hc HDA19的CRISPR-Cas9基因编辑载体和过表达载体进行转基因验证。通过针刺—真空渗透辅助农杆菌介导法将CRISPR-Cas9基因编辑载体转化红麻,获得了阳性植株,但其靶位点未发生编辑。过表达Hc HDA19对烟草及拟南芥花粉的育性没有影响,但Hc HDA19通过调节FLC的表达影响拟南芥的抽薹时间,还通过H3K27和H3K9位点的去乙酰化调控相关基因的表达来提高拟南芥对盐胁迫的耐受性。
李园媛[4]（2020）在《水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究》文中指出目的:通过水提法制备水蛭提取液,分别采用凝血酶间接检测提取液中水蛭素含量（根据2015版药典）和高分辨液质联用QE技术检测提取液成分,以确定水蛭提取液的主要成分。通过观察水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma RB）WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响,验证水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞生长和侵袭的作用。通过水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）、缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a HIF-1a）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9 MMP-9）的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（Phosphatidylinositol 3kinase/Protein Kinae B PI3K/AKT）通路的影响,阐明水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞可能的分子机制。通过观察水蛭提取液对人脐静脉内皮细胞（Human Vascular endothelial cells HUVEC）的活性影响及表达VEGF和血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR2）的影响,以此来研究水蛭提取液抑制肿瘤血管生成的潜能。方法:1.水蛭提取液的制备和检测:水提法制备水蛭提取液,并利用凝血酶间接测定水蛭素的含量;高分辨液质联用-QE技术分析水蛭的主要成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 将WERI-RB-1细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 以0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响; 以2个实验浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响; transwell侵袭实验检测2个实验浓度对WERI-RB-1细胞侵袭作用的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Elisa实验检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,RT-PCR检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Western Blot检测蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a、MMP-9、PI3K、人磷酸化AKT蛋白（Human phosphorylated AKT protein p-AKT）蛋白含量的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 将HUVEC细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,RT-PCR检测水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,Western Blot检测蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2蛋白含量的影响。结果:1.水蛭提取液的制备和检测:根据2015版《中华药典》中使用凝血酶测定水蛭提取液中水蛭素的浓度,经过多次反复提取及测定,水蛭提取液中水蛭素浓度保持相对稳定。高分辨液质联用分析仪-QE分析结果表明:水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 0.04U/ml、0.08U/ml的水蛭提取液组在48h对RB细胞的抑制率分别是9.70%、9.92%,与对照组比较,差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 实验组药物浓度干预的RB细胞主要阻滞在G2/M期。对照组、0.04U/ml水蛭提取液组、0.08U/ml水蛭提取液组处于G2/M期的阳性细胞率（%）分别为3.00±2.32、12.59±5.36、14.79±4.12（对照组与水蛭提取液组比较,P<0.01）。 实验组水蛭提取液浓度均可诱导RB细胞凋亡率上调,以上3组细胞凋亡率依次分别为4.64±2.56、37.91±3.44、33.05±2.25（与对照组比较,P<0.01）。 实验组Transwell下室中移行的、每高倍视野细胞数目均较对照组显着减少,3组检测结果（OD值）依次分别为1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42（与对照组比较,P<0.01）。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: Elisa实验结果显示:与对照组比较,0.04U/ml和0.08U/ml2个水蛭提取液浓度培养基上清中VEGF的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,HIF-1a和MMP-9 m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 0.04U/ml和0.08U/ml水蛭提取液干预WERI-RB-1细胞48h后,细胞的抑制率分别为12.96±1.59、14.81±2.17,与对照组比较差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.水提法提取的水蛭提取液中水蛭素含量相对稳定。水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液通过抑制WERI-RB-1活性、引起周期阻滞、诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭等作用对视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞发挥抑制作用。3.水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞,同时抑制WERI-RB-1细胞中HIF-1a、MMP-9活性。4.水蛭提取液可抑制HUVEC细胞活性,抑制HUVEC细胞表达VEGF、VEGFR2蛋白活性。综上所述,在体外实验中,水蛭提取液在一定程度上可能通过VEGF/PI3K/AKT通路和HIF-1a、MMP-9因子影响WERI-RB-1细胞周期分布、凋亡、侵袭作用,从而发挥抑制RB的作用。同时发现水蛭提取液可能通过抑制VEGF、VEGFR2表达抑制脐静脉内皮细胞。我们的研究结果表明:水蛭提取液对RB细胞具有抑制作用,同时可能对RB血管也有抑制作用。从中医理论上进一步验证了其活血化瘀、其破血消瘕的作用。以上研究结果为开发新型抗肿瘤制剂水蛭提供了一定的临床前研究资料。
唐海欧[5]（2019）在《转录因子Delta5 Stat5a对人类乳腺癌细胞转录组的影响》文中研究表明Stat5（Signal transducer and activator of transcription 5）是具有多重功能的转录因子,作为信号转导和转录活化蛋白（signal transduction and activator of transcription,Stat）家族的组成成员,Stat5具有两个亚型--Stat5a和Stat5b,两者高度同源,且功能相似,主要参与调节乳腺的生长发育、细胞的增殖与凋亡。此外,在肿瘤的发生、增殖与转移过程中起着重要的作用。Delta5 Stat5a是Stat5a的转录剪接变体（为区别于Delta5 Stat5a或?5 Stat5a,将原Stat5a称为FL Stat5a）,由Tan等首次克隆并报道,该变体是Stat5a基因表达产物mRNA前体选择性剪接的产物,其对应于成熟mRNA中对应于外显子5的90个核苷酸序列缺失,致使相应蛋白质产物的N端30个氨基酸残基的缺失。本课题主要探讨并比较过表达FL Stat5a及Delta5 Stat5a对人类乳腺癌细胞MCF-7转录组的影响;方法:通过构建过表达FL Stat5a及Delta5 Stat5a慢病毒稳转细胞株,提取稳转细胞总RNA并分离纯化,然后通过高通量测序技术--转录组测序技术（RNA sequencing,RNA-seq）,得出测序数据并利用生物信息学和统计分析。结果:1)样品中FL Stat5a组检测到的基因数为22319个,Delta5 Stat5a组基因数为21904个,Con组基因数为23960个。2)转录本表达量整体水平分析,Delta5Stat5a组转录本数量为23044个,FL Stat5a组转录本数量为23330个,con组检测到的转录本数目为25688个;3)检测到的con组的mRNA数量为16334个,Delta5Stat5a组的mRNA数量为15184个,FL Stat5组的mRNA数量为15364个。FL Stat5a与Delta5 Stat5a相比,有明显差异的mRNA有23个,Delta5 Stat5a上调的mRNA有17个,下调的mRNA有6个。4)检测到的con组的ncRNA数目是9354个,Delta5 Stat5a组的ncRNA数目是7860个,FL Stat5a组的ncRNA数目是7966个。相对于与FL Stat5a组,Delta5 Stat5a组显着上调的ncRNA数量是1个,显着下调ncRNA数量是11个。5)con组检测到新转录本ncRNA的数目是104个,Delta5Stat5a组新转录本ncRNA的数目是232个,FL Stat5a组新转录本ncRNA的数目是346个。6)KEGG通路富集分析显示FL Stat5a组与Delta5 Stat5a组差异表达的ncRNA的靶基因主要富集于癌症相关通路,包括p53信号通路,NF-kappa B信号通路等。7)GO功能分析结果示FL Stat5a组与Delta5 Stat5a组差异表达的ncRNA的靶基因主要富集于生物过程中核糖核蛋白复杂生物起源、核转录mRNA分解代谢过程、细胞组成组织或生物发生、mRNA酸分解过程、核糖核酸分解过程、rRNA的加工与代谢过程、核糖体生物合成、主要代谢过程、细胞代谢过程;富集于细胞组分的细胞内的细胞器,细胞内的核糖核蛋白复合体,细胞内的部分,胞质核糖体,细胞内细胞器的部分等;富集于分子功能的RNA的结合,组蛋白乙酰转移酶活性（H4-K5特异性、H4-K8特异性、H4-K16特异性）,H4组蛋白乙酰转移酶活性,核糖体的结构组成,转移酶活性,转移氨基酰基以外的酰基,结构分子活性,转移酶活性,转移酰基等。结论:1)过表达FL Stat5a和Delta5 Stat5a能影响MCF-7乳腺癌细胞的基因表达。2)过表达FL Stat5a和Delta5 Stat5a基因,稳转细胞的表达谱及其覆盖度发生改变,表达水平变化较大的主要为1、11、16号染色体。3)过表达Delta5 Stat5a能促进乳腺癌细胞的增殖。4)KEGG通路富集分析示FL Stat5a组与Delta5 Stat5a组差异表达的ncRNA的靶基因主要富集于癌症相关通路:p53信号通路,NF-kappa B信号通路,并可能过表达Delta5 Stat5a通过p53信号通路、NF-kappa B信号通路更能促进细胞增殖与转移。此次研究对于进一步探究FL Stat5a和Delta5 Stat5a在人类乳腺癌细胞中的分子机理提供了十分重要的数据支撑,为日后更加深入地了解FL Stat5a和Delta5Stat5a的作用夯实了基础。
梁引库[6]（2016）在《血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究》文中进行了进一步梳理Kringle 5是纤溶酶原的第五个片段,分子量约8KD,是Cao等于1977年通过蛋白酶消化人纤溶酶原和分子克隆的方法得到的。Kringle 5主要作用于血管内皮细胞,使血管内皮细胞生长周期停滞而导致血管内皮细胞凋亡,Kringle 5还能抑制血管内皮细胞的迁移。但Kringle 5对于其它细胞,如成纤维细胞、人干细胞等没有作用。虽然Kringle 5具有抑制血管内皮细胞增殖和分化的作用,对于治疗肿瘤具有重要的意义,但Kringle 5的作用靶点是什么?它是如何导致血管内皮细胞凋亡的?等等问题,到目前为止,还没有明确的答案。针对这种情况,本研究以原核表达的Kringle 5为靶蛋白筛选Kringle 5在体内的结合蛋白,并通过SPR和前沿色谱法确认了VDAC-1与Kringle 5的结合和相互作用。我们试图建立一种通过噬菌体肽库技术结合分子对接技术和SPR技术筛选蛋白体内结合蛋白的快速筛选系统,为Kringle 5体内结合蛋白的筛选和研究其抑制血管内皮细胞生长机理奠定基础。本研究主要取得了以下成果：（1） 根据NCBI数据库中人Kringle 5蛋白的基因序列设计引物扩增出Kringle 5基因,将其成功表达在pET28b原核表达载体中,并在BL21细胞中诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现,带有His标签的Kringle 5蛋白出现在破碎细胞上清液中。上清液经镍亲和柱分离后,得到纯度约为86%的重组Kringle 5蛋白。（2）以Kringle 5蛋白为靶蛋白,对噬菌体环7肽库进行筛选。4轮筛选后,噬菌体回收率从6.25×10-9提高到了1.57×10-7,噬菌体得到富集。挑取噬菌体单克隆测序后发现,随机挑取的50个单克隆分别表达13个短肽,ELASA分析这13个短肽与Kringle5的亲和力,最终确定IGNSNTL为Kringle 5的高亲和短肽。以该短肽比对NCBI人源蛋白质数据库,共找到103种与该短肽同源性较高的蛋白。逐一比对分析这103种蛋白的氨基酸序列及功能,发现这些蛋白归属于28类。根据这28类蛋白的功能、作用以及它们在细胞内的作用途径和作用方式,初步认确定Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor等9种蛋白可能是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。根据Kringle 5在人体内的作用方式和作用途径推断,VDAC-1、Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12可能为Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。（3）同源建模和直接建模的方式构建了Kringle 5及初步筛选的9种蛋白的晶体结构。HEX软件分析了Kringle 5蛋白与这9种蛋白的作用,分子对接结果发现Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和Protein C-ets-2与Kringle 5具有相对较低的结合自由能,其结合自由能分别为-837.55 J/mol、-822.65 J/mol和-832.6 J/mol.蛋白活性位点分析发现,Kringle 5与Protein C-ets-2作用时并没有进入它形成的活性口袋,但进入了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2形成的活性口袋中。分析Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、 VDAC-1、ABCA12和Endothelin B receptor isoform X2蛋白活性中心参与与Kringle 5作用的氨基酸,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12活性中心参与对接的氨基酸多数出现在IGNSNTL筛选短肽中,说明IGNSNTL短肽较好地模拟了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白的活性中心。根据化学反应能量最低原则和化学反应空间匹配原则,推断Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和VDAC-1蛋白为Kringle 5蛋白的结合蛋白。（4）为了证明噬菌体展示技术筛选的9种蛋白能否与Kringle 5作用,明确分子对接技术在结合蛋白筛选中的作用,本部分构建了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白的原核表达载体,经诱导表达后,利用SPR技术分析了Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12等9种蛋白与Kringle 5蛋白的相互作用。SPR分析表明,除了VDAC-1蛋白,Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor和ABCA12等8种蛋白均不能与Kringle 5发生作用,表明VDAC-1是Kringle 5蛋白的体内结合蛋白。（5）根据NCBI中VDAC-1的基因序列,以pCMV6-XL5-VDAC-1为模版克隆了VDAC-1基因,构建了VDAC-1蛋白的原核表达载体pET28b-VDAC-1,并在BL21细胞中诱导表达成功。SDS-PAGE电泳分析发现VDAC-1蛋白以包涵体的形式表达。经变性复性后分离和柱上复性分离两种分离方法的分离后,变性复性后分离的分离方法蛋白产率高于柱上复性分离方法蛋白的产率。研究VDAC-1蛋白复性条件发现,当复性条件为溶液pH值8.0、氧化型谷胱甘肽浓度0.2 mmol/L、还原型谷胱甘肽的浓度1 mmol/L时VDAC-1蛋白的复性产率最高,蛋白产率可达55.6%。（6）优化Kringle 5在CM5芯片上的固定条件后,以该优化条件固定Kringle 5于CM芯片上,分析了VDAC-1与Kringle 5相互作用的热力学参数,结果表明,VDAC-1与Kringle 5的结合常数为2.43×e3 L/mol、解离常数为4.12×e-4L/mol。前沿色谱法进一步分析了Kringle 5与VDAC-1的相互作用,结果表明VDAC-1能与固定化的Kringle 5发生相互作用,其结合常数为23.54 L/mol,解离常数为0.097 L/mol。因此VDAC-1为Kringle 5的体内结合蛋白。本研究通过噬菌体展示肽库技术结合分子模拟对接技术筛选Kringle 5的体内结合蛋白,SPR证明该法能有效缩小Kringle 5结合蛋白的筛选范围,通过该法筛选的Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor、VDAC-1和ABCA12蛋白中的VDAC-1蛋白经SPR与前沿色谱证明能与Kringle 5发生作用。因此以噬菌体展示肽库技术为基础结合分子模拟对接技术和SPR技术筛选靶蛋白体内结合蛋白的方法是有效和可行的。
熊员焕[7]（2015）在《重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究》文中研究表明目的在克隆日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子Sjcystatin基因,并表达重组Sjcy statin蛋白质分子（recombinant Sjcy statin protein, rSjcystatin）的基础上,初步探讨其对免疫性流产小鼠模型的流产抑制作用及其对CD4+CD25+Treg、FOXP3、Th1/Th2型细胞因子的影响,为虫源性免疫抑制因子用于治疗女性不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）及其它自身免疫性疾病积累实验室研究阶段的科学依据。方法（1）rSjcy statin的表达与纯化：将Sjcystatin基因的开放阅读框（ORF）连接到pET-3C载体上,并将其转化到大肠杆菌BL21AI中,阿拉伯糖诱导rSjcy statin表达,用镍离子螯合亲和层析柱纯化rSjcy statin,将纯化产物进行SDS-PAGE电泳和western blotting鉴定。（2）rSjcy statin的干预效果研究：120只CBA/J雌性小鼠被随机分成4组：正常妊娠组,10只；URSA组,10只；环孢素A组,10只；rSjcystatin组,90只。rSjcystatin组又分为9个亚组,每亚组CBA/J雌性小鼠10只,各亚组孕鼠分别于孕0.5d、孕4.5d、孕9.5d进行腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、20 mg/kg的rSjcystatin;CsA组孕鼠于孕4.5d腹腔注射5mg/kg的CsA。孕14.5d处死各组孕鼠,计算胚胎吸收率。（3）rSjcy statin的干预机制研究：将rSjcystatin改善胚胎吸收率效果最佳亚组（4.5d,10mg/kg）与正常妊娠组、URSA组、CsA组进行对比研究,运用流式细胞分析技术检测孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例；采用FOXP3免疫组化标记孕鼠子宫蜕膜病理切片,计算光密度IOD值；测序分析检测FOXP3转录水平差异,并用iTRAQ方法定量分析孕鼠蜕膜FOXP3蛋白水平：ELISA法测定孕鼠血清IFN-γ、IL-10的含量；RT-PCR法检测孕鼠脾脏组织TNF-α、IL-4的转录水平。结果（1）rSjcystatin各亚组的胚胎吸收率均明显低于URSA组（p<0.01）；其中,效果最佳的是孕4.5d,10mg/kg亚组,其胚胎吸收率降至（5.88+0.13）%,显着低于田cystatin其他各亚组（P<0.01）；与正常妊娠组、CsA组相比较,均无显着性差异（p>0.05）。（2）rSjcystatin组的孕鼠脾脏CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中所占比例为（9.37+0.42）%,显着高于URSA组（p<0.01）；与正常妊娠组、CsA组相比较,无显着性差异（p>0.05）。（3）rSjcystatin组、正常妊娠组、CsA组的孕鼠子宫蜕膜病理切片FOXP3免疫组化标记的IOD值分别为7947.66±25.38、14754.9±36.27、11044.86±49.88,均显着高于URSA组的57.93±15.32（p<0.01）；URSA组蜕膜FOXP3 mRNA转录及蛋白的表达水平显着低于其他三组,rSjcy statin能上调蜕膜FOXP3 mRNA及蛋白的表达,接近CsA的上调水平。（4）rSjccy statin组血清IL-10/IFN-γ比值（0.94±0.15）与正常妊娠组（0.85±0.25）、CsA组（0.96±0.30）相比较,均无显着性差异（p>0.05）,但显着高于URSA组（0.21±0.03）（p<0.01）。（5）rSjcyystatin组孕鼠脾脏组织IL-4/TNF-α比值（0.98±0.23）与正常妊娠组（0.99±0.18）、CsA组（0.92±0.15）相比较,均无显着性差异（p>0.05）,但显着高于URSA组（0.074±0.05）（p<0.01）。结论（1）Sjcystatin基因可通过原核高效表达及纯化来获取足量的重组蛋白rSjcystatin,经鉴定其基因与蛋白质氨基酸序列,以及生化特性等均与Sjcystatin目标蛋白一致。（2）初步证实rSjcystatin用于干预不明原因复发性流产小鼠时能显着降低孕鼠的胚胎吸收率,改善妊娠结局。（3）初步阐明rSjcystatin对不明原因复发性流产小鼠发挥流产改善作用的机制,可能是通过诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖及母胎界面FOXP3的阳性表达,进而对Th1/Th2发挥免疫调节作用,使其向Th2型免疫应答偏倚,最终减少胚胎的免疫损伤,抑制流产。
叶湘漓[8]（2013）在《组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究》文中研究指明心脏是机体最早形成并行使功能的器官,同时也是人体中最为辛苦的器官,其工作状态的好坏与人类的健康息息相关;心脏一旦出现疾患,将直接影响到人类的生活甚至危及生命。血管是构成机体循环系统的重要组成成分,机体通过血管系统将血液、氧气、CO2和营养物质等输送到各个组织和器官,血管对于维持机体的生命和健康是必须的,它几乎参与了所有的疾病过程。世界卫生组织的调查显示,心血管病已经成为人类健康的第一杀手,因此,心脏及血管一直是整个生物医学界共同关注的焦点。近些年来尽管对于心脏及血管的研究已取得了很大进展,但是其分子机制如心肌分化的机制、血管发生与形成的机制等仍远未得到阐明;通过研究心脏及血管发育的相关分子机制、以期为心血管病的治疗提供帮助成为目前基础研究和临床实践亟待解决的重大课题之一。组蛋白的修饰作用是表观遗传学研究的一个重要领域,包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化等,其修饰效应可因修饰方式的不同或者组蛋白修饰位点的不同而呈现差异性;不同组蛋白修饰之间相互关联,并可以动态地组合在一起形成“组蛋白密码”,在基因的时空表达调控、细胞命运决定、细胞生长等过程中发挥着重要的作用。作为一种重要的表观遗传学调控机制,组蛋白甲基化修饰在多种生命过程中发挥了重要的作用;细胞内有多种组蛋白甲基化酶和去甲基化酶共同调节组蛋白的修饰状态,在组蛋白甲基化状态确定后,多种效应分子特异的读取修饰信息,从而参与基因转录调控过程。既往研究表明SMYD1是心脏和肌肉特异表达的组蛋白甲基转移酶,在细胞特化、细胞分化和细胞成熟等过程中发挥着重要作用,尤其是在心肌细胞的分化、心脏的形态发生以及肌原纤维的形成等方面。Nkx2.5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一,也是影响心脏发育的关键性转录因子。本研究首次发现SMYD1与Nkx2.5存在相互作用:利用DMSO处理的P19细胞,RT-PCR发现SMYD1与Nkx2.5的表达水平在P19细胞分化的不同时期均呈现上升趋势,暗示SMYD1可能与P19细胞的分化有关,两者在P19细胞的分化中存在表达的相关性;过表达Nkx2.5同样会上调SMYD1基因的表达,表明Nkx2.5能够调节SMYD1基因的表达;通过对SMYD1的启动子序列进行分析,发现位于-632位的TCACTTGA位点可能是Nkx2.5的结合区域;运用EMSA实验证明Nkx2.5的HD结构域能够与SMYD1基因的启动子相结合,CHIP实验的结果也表明Nkx2.5蛋白能与SMYD1的启动子结合;为了进一步证明SMYD1与Nkx2.5存在相互作用,细胞定位分析显示Nkx2.5与SMYD1蛋白同样定位在细胞核中,Co-IP实验证明SMYD1与Nkx2.5有直接的相互作用,Pull-down实验也得到了相同的结果;利用荧光素酶活性分析实验,证明Nkx2.5与SMYD1的相互作用可以影响Nkx2.5下游基因的表达;推测SMYD1可能通过Nkx2.5参与心肌的分化过程。已有的研究表明SMYD1特异性表达于心脏和肌肉组织,目前还很少有SMYD1在其它组织细胞中表达的报道。本研究首次发现SMYD1可以在血管内皮细胞中表达,沉默SMYD1将影响内皮细胞的迁移和内皮细胞管状结构的形成,体内和体外实验证明了 SMYD1与SRF的相互作用,EMSA实验表明SMYD1可与SRF形成复合物,通过前反馈机制增强SRF的DNA结合活性;SMYD1作为SRF的相互作用蛋白,在内皮细胞的迁移和内皮细胞管状结构的形成中具有重要的作用。综上所述,SMYD1可能在心肌分化以及血管发生的过程中起着重要的作用。其它工作（1）:构建基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一,构建基因敲除打靶载体是基因敲除技术的关键一步。采用常规的分子克隆方法构建基因打靶载体往往存在一些难以克服的缺陷,对于某些难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建;而传统的基因敲除技术即完全基因敲除则无法避免某些具有重要功能基因的敲除后所带来的早期胚胎致死问题,也无法避免另外一些基因被敲除后,其表型特征可能随着表达组织的不同或者发育阶段的不同而出现差异的现象;条件性基因敲除技术通过加入具有位点特异性的重组系统,将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠特定发育时期或者特定类型的组织细胞中,使这种修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态。本研究通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点更加准确的插入到了目标位置,实现了条件性基因敲除打靶载体的快速构建。GPCRs几乎参与调控了所有已知的生理过程,具有极其重要的生理功能;GPCR粘附家族是GPCRs家族中第二大的亚家族,由30多个成员组成,在细胞粘附以及细胞内外信号的转导等方面具有重要的作用;不过,目前绝大多数的GPCR粘附家族成员的功能及其配体都还未知,因此又被称为孤儿受体。GPR126最初是从人脐静脉内皮细胞中分离出来的,已有的研究表明GPR126可能是胚胎发育以及心血管生成过程中的关键因子,并与神经髓鞘的形成以及神经细胞之间的信号传导等有关;为了进一步探索GPR126的作用机制,快速构建了 GPR126条件性基因敲除打靶载体,拟以此为基础构建GPR126基因敲除小鼠模型,为在动物体内研究GPR126的功能奠定了基础。其它工作（2）:神经突起生长导向因子Netrins是一个与层粘连蛋白相关的、高度保守的小分子分泌蛋白家族,在神经发育所需的轴突导向及细胞迁移中发挥着吸引或排斥的双重导向作用,其同源物在果蝇、斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠等多种模式动物中均已得到发现。Netrins分为两个亚家族:典型netrins和netrin-Gs;由于netrin-Gs亚家族各成员之间具有高度的相似性,而目前在人类中得到确证的只有netrin-G1,故推测在人类中应该还有netrin-Gs亚家族的其它成员及其编码基因的存在。从20周龄人胚中提取脑组织的总RNA,用PCRcDNA文库试剂盒制备脑组织cDNA文库,再用特异性引物进行PCR扩增,得到1条人netrin-G的全长cDNA,并将其命名为人netrin-G2;用Northern杂交研究其表达,用进化树分析其与netrins家族各成员间的关系,证实人netrin-G2确实为netrin-G亚家族的1个新成员;人netrin-G2基因位于染色体的9q34,大小为2428 bp,包含1个1593 bp的假定开放阅读框,起始密码子为86位的甲硫氨酸,终止密码子为1678位的TGA,可编码1个大小为530个氨基酸残基的蛋白质;Northern杂交显示,人netrin-G2在脑组织中特异性表达,而在其它组织中却很少发现,推测人netrin-G2可能在中枢神经系统的发育过程中具有重要的作用,可能与刺激性神经冲动的传递以及神经调节有关。
王常荣[9]（2013）在《黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究》文中指出大型真菌作为天然活性成分的重要来源,其代谢产物种类丰富,具有多种独特的化学结构和生理活性。本实验以食用真菌为研究对象,围绕其抗氧化活性成分的分离纯化,抗HIV-1和免疫调节活性以及相关作用机制进行研究。本研究首先利用红细胞溶血和脂质过氧化抑制实验,对64株大型真菌的粗提物进行了抗氧化活性测定,确定以黄伞（Pholiota adiposa）子实体作为研究对象。然后利用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、NKA大孔吸附树脂、Sephadex G-15和Sephadex LH-20分子筛凝胶层析以及高效液相色谱（HPLC）等层析方法,首次从黄伞中分离纯化得到三个小分子活性成分PB3、HEB和PC3-3。通过定性试验、质谱、红外光谱以及与相应标准品HPLC保留时间的比对,确定第一个成分为腺苷（adenosine, C10H13N5O4, PB3）,第二个成分为没食子酸甲酯（methyl gallate, C8H8O5, HEB）,第三个成分为甾体皂苷类化合物（steroidal saponins,PC3-3）。反应浓度为250μg/ml时,PC3-3和HEB对红细胞氧化溶血的抑制率为26.9%和82.4%,抑制脂质过氧化率达88.2%和17.3%,PC3-3和HEB分别在不同的体外检测体系中显示出极强的抗氧化活性。此外,HEB对超氧阴离子和DPPH自由基都具有较强的清除活性,250μg/ml浓度下清除率分别达到71.4%和85.6%。为了大规模筛选具有胞内抗氧化活性的化合物,本实验将具有氧化还原敏感性质的绿色荧光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein, croGFP）基因在大肠杆菌中进行表达,构建了能够通过GFP荧光强度水平定量表征细菌胞内氧化还原水平的检测模型。鉴于抗氧化与抗HIV-1之间的密切关系,进一步将croGFP基因在HIV-1病毒宿主细胞系TZM-BL中进行表达,TZM-BL细胞基因组内整合了HIV-LTR调控的荧光素酶基因luc序列,从而得到了通过GFP荧光强度表征胞内氧化还原水平、荧光素酶活性表征病毒LTR激活水平的抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型。利用大肠杆菌胞内抗氧化筛选模型（E. coli-croGFP）,对具有体外抗氧化活性的真菌提取物进行再次检测发现,仅有包括黄伞、红菇、NK2100、猴头、褐孔菌和早北c滑在内的六种食用菌菌丝浸提物能够显示一定的胞内抗氧化活性,证明体外抗氧化成分并不一定能够进入细胞内发挥活性。利用抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型（TZM-BL-croGFP）,通过流式细胞仪和发光检测仪对细胞内的GFP荧光强度和Luc酶活性进行检测发现,活性氧刺激使细胞内氧化还原水平升高会直接激活HIV-1启动子LTR调控的下游基因表达,证实了氧化应激与HIV-LTR转录激活之间的直接关系。HEB能够有效地抑制双氧水诱导的胞内氧化应激,抑制率IC50达26.0μM；并且抑制了由于细胞内氧化水平升高引起的HIV-LTR激活,能够将200μM H2O2刺激指示细胞系产生的信号从18.2%降低到2%左右；HEB还能够抑制HIV-1假病毒感染TZM-BL细胞的复制增殖,其抑制率IC50达到11.9μM,证明了抗氧化剂HEB具有抗HIV-1活性。这两个胞内检测模型具有接近生理状态、成本低、操作简单快速、重复性好等优点,适合用于抗氧化、抗HIV-1活性成分的大规模筛选。’为进一步对HEB的抗氧化、抗HIV-1作用机制进行研究,本实验利用Western blot对细胞内核转录因子NF-κB活化情况进行检测发现,H202能够激活细胞内NF-κB活化,促进阻遏蛋白IκB降解,使NF-κB与IκB解离并进入细胞核内行使功能。天然抗氧化成分HEB能够有效抑制NF-κB的活化入核,并防止IκB降解,从而抑制H202引起的氧化应激导致的NF-κB信号途径活化,阻止NF-κB与HIV-1启动子LTR上的κB靶序列结合,抑制病毒复制转录。本研究发现,抗氧化成分HEB具有生物多效性,能够通过多个靶点抑制HIV-1病毒复制。与病毒感染2h完成进入过程后给药相比,HEB预保护能够更好地抑制HIV-LTR激活,证明HEB对病毒感染的进入过程具有一定的抑制作用,但又不仅限于此。进一步利用实验室已有的HIV-1三大关键酶活性检测体系进行实验发现,抗氧化剂HEB对HIV-1逆转录酶和整合酶活性都有不同程度的抑制作用,抑制率IC50分别达到80.1μM和228.5μM,并且在200μM浓度下对HIV-1蛋白酶的抑制率也达到17%左右。所以HEB对HIV-1生长周期中包括病毒进入、逆转录、整合和成熟蛋白加工在内的多个过程产生影响。细胞因子在免疫系统中作用十分重要,黄伞中的活性成分能够调节细胞因子的转录。通过小鼠腹腔给药体内实验,实时定量PCR检测脾细胞内细胞因子的mRNA变化情况,结果发现HEB能够显着提高IFN-γ的表达到两倍以上,同时下调Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达至50%左右,有利于调节艾滋病患者体内Th1/Th2型细胞因子失衡的状态。而PB3则通过提高细胞因子合成抑制因子IL-10的表达至约1.5倍,以及不同程度的下调包括IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6在内的多种细胞因子的表达,体现出较强的抗炎症作用。综上所述,本研究从抗氧化、抗HIV-1和免疫调节三方面对黄伞中的活性成分进行了检测,并且对其活性作用靶点和作用机制进行了研究,同时构建了两种新型抗氧化、抗HIV-1活性胞内检测模型,并对这两种活性之间的关系进行了研究和探讨。具有生物安全性和多效性的天然活性成分为克服HIV-1病毒耐药性提供了新的方向,也为开发新型抗艾滋药物奠定了基础,具有十分重要的研究意义和良好的应用前景。
黄莉钧,石丁波,姚亚超,李磊,戴智育,张婷,高国全,杨霞[10]（2013）在《具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化》文中指出目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5（K5）突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因（模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变）,通过PCR从本实验室保存的pET22b（+）/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21（DE3）原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。
二、重组血管生成抑制因子r-K4K5的分离纯化与功能鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组血管生成抑制因子r-K4K5的分离纯化与功能鉴定（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）人层粘连蛋白α3链LG1结构域是人纤溶酶原Kringle5在内皮细胞表面的一个受体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.2.1 人纤溶酶原Kringle5 |
| 1.2.2 层粘连蛋白 |
| 1.3 研究现状 |
| 1.4 研究内容及方法 |
| 1.4.1 研究思路及内容 |
| 1.4.2 研究方法 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 Kringle5 可能受体的筛选与初步确定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 可能受体序列的搜索与比对 |
| 2.3.2 可能受体序列的筛选原则 |
| 2.3.3 LG1蛋白的模型构建 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 筛选与验证Kringle5 具有高亲和力的短肽 |
| 2.4.2 可能受体序列的筛选与初步确定 |
| 2.4.3 LG1蛋白的模型构建 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组Kringle5和重组LG1 蛋白的诱导表达纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 .试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组Kringle5 蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.3.2 重组LG1蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.3.3 SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 重组Kringle5 的表达纯化 |
| 3.4.2 重组LG1的表达纯化 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Kringle5与LG1 之间的相互作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 仪器及试剂 |
| 4.2.2 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 生物素标记Kringle5 |
| 4.3.2 Ligand blot实验 |
| 4.3.3 固定化Kringle5 色谱模型的建立 |
| 4.3.4 Kringle5色谱柱的表征 |
| 4.3.5 LG1在Kringle5 色谱柱上突破曲线的测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Ligand blot结果 |
| 4.4.2 固定化Kringle5 色谱柱的表征 |
| 4.4.3 LG1在Kringle5 色谱柱上突破曲线的测定 |
| 4.4.4 结合常数和结合位点数 |
| 4.4.5 结合位点类型 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Kringle5与LG1 受体结合后对细胞功能的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 仪器及试剂 |
| 5.2.2 试剂配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 CCK-8实验 |
| 5.3.3 统计学方法 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组Kringle5 对内皮细胞增殖的影响 |
| 5.4.2 重组Kringle5 与层粘连蛋白α3 结合后对内皮细胞增殖的影响 |
| 5.4.3 重组Kringle5 对内皮细胞凋亡的影响 |
| 5.4.4 重组Kringle5 与层粘连蛋白α3 结合后对内皮细胞凋亡的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 Kringle5与LG1 结构域之间的分子动力学模拟研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 Kringle5与LG1 结构域的分子对接 |
| 6.3.2 野生型复合物分子动力学模拟 |
| 6.3.3 自由能计算 |
| 6.3.4 突变复合物分子动力学模拟 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 分子对接 |
| 6.4.2 模拟体系的稳定性分析 |
| 6.4.3 自由能的计算 |
| 6.4.4 突变Kringle5与LG1 复合物的动力学研究 |
| 6.4.5 Kringle5与LG1 之间的分子识别 |
| 6.4.6 Kringle5与LG1 之间的相互作用 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）红麻蛋白乙酰化修饰调控细胞质雄性不育及相关功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 红麻细胞质雄性不育(CMS)机理研究 |
| 1.1.1 红麻CMS细胞学研究 |
| 1.1.2 线粒体与红麻CMS |
| 1.1.3 转录组与红麻CMS |
| 1.1.4 表观遗传与红麻CMS |
| 1.1.5 蛋白质及其翻译后修饰与红麻CMS |
| 1.2 蛋白质乙酰化修饰 |
| 1.2.1 组蛋白的乙酰化修饰 |
| 1.2.2 非组蛋白的乙酰化修饰 |
| 1.3 组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的功能 |
| 1.3.1 HDACs在植物生长发育过程中的作用 |
| 1.3.2 HDACs在植物逆境胁迫反应中的作用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 红麻CMS系UG93A及保持系UG93B花药乙酰化修饰蛋白质组学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 UG93A和 UG93B花药总蛋白乙酰化修饰水平分析 |
| 2.2.2 UG93A和 UG93B花药乙酰化蛋白质组学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 能量代谢相关酶与花粉发育 |
| 2.3.2 蛋白质二硫键异构酶与花粉发育 |
| 2.3.3 转录翻译因子与花粉发育 |
| 2.3.4 信号转导因子与花粉发育 |
| 2.4 小结 |
| 3 乙酰化修饰对红麻能量代谢关键酶GAPDH的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 GAPDH基因的克隆与定点突变 |
| 3.2.2 真核表达GAPDH及 GAPDH-Mut188 重组蛋白 |
| 3.2.3 原核表达SRT2重组蛋白 |
| 3.2.4 GAPDH及 GAPDH-Mut188 重组蛋白的酶活测定 |
| 3.2.5 SRT2与GAPDH的相互作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 乙酰化修饰在代谢调控中发挥重要作用 |
| 3.3.2 Sirtuin类组蛋白去乙酰化酶家族成员SRT2 的功能多样性 |
| 3.4 小结 |
| 4 红麻组蛋白去乙酰化酶家族基因的克隆与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 UG93A和 UG93B花药组蛋白乙酰化修饰水平分析 |
| 4.2.2 HcHDACs的序列分析 |
| 4.2.3 HcHDACs的进化关系和氨基酸序列保守域分析 |
| 4.2.4 HcHDACs的表达模式分析 |
| 4.2.5 HcHDACs的亚细胞定位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 红麻HcHDACs家族基因的鉴定及表达模式 |
| 4.3.2 HDACs家族基因参与花发育过程的调控 |
| 4.3.3 红麻HcHDACs家族蛋白的亚细胞定位 |
| 4.4 小结 |
| 5 红麻HcHDA19基因的功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pYLCRISPR-Cas9Pubi-HDA19 载体的构建及基因编辑活性 |
| 5.2.2 pBI121-HDA19 载体的构建 |
| 5.2.3 pYLCRISPR-Cas9Pubi-HDA19 载体转化红麻 |
| 5.2.4 pBI121-HDA19 载体转化烟草 |
| 5.2.5 pBI121-HDA19 载体转化拟南芥 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 针刺—真空渗透辅助农杆菌介导转化法为红麻基因功能研究提供新的方法 |
| 5.3.2 pYLCRISPR-Cas9Pubi-HcHDA19 载体编辑效率分析 |
| 5.3.3 HcHDA19 基因通过调节FLC的表达影响拟南芥的抽薹时间 |
| 5.3.4 HcHDA19基因增强拟南芥对盐胁迫的耐受性 |
| 5.4 小结 |
| 6 全文结论 |
| 6.1 主要结论与创新之处 |
| 6.1.1 本研究主要结论 |
| 6.1.2 本研究创新之处 |
| 6.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间参与科研项目、论文发表和发明专利情况 |
（4）水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 水蛭提取液的制备和主要成分分析的初步研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法与步骤 |
| 1.2.1 水蛭提取液的制备和含量检测 |
| 1.2.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 水蛭提取液的制备和水蛭素含量测定 |
| 1.3.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液主要成 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 水蛭提取液的制备和检测的初步研究 |
| 1.4.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 第二部分 水蛭提取液对WERI-Rb-1 细胞活性、周期、凋亡、侵袭的影响 |
| 2.1 实验细胞、试剂及配制、仪器设备和耗材 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养、传代和冻存 |
| 2.2.1 细胞培养和传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 CCK-8法检测水蛭提取液对细胞的活性影响 |
| 2.3.2 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞周期的影响 |
| 2.3.3 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 水蛭提取液对 WERI-RB-1 侵袭能力的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同浓度药物对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.5.2 流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响 |
| 2.5.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5.4 transwell 实验检测水蛭提取液对 WER-Rb-1 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.6.2 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞周期的影响 |
| 2.6.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡影响 |
| 2.6.4 细胞凋亡与增殖 |
| 2.6.5 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞侵袭能力的影响 |
| 第三部分 水蛭提取液对WER-Rb-1 细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究 |
| 3.1 实验细胞、试剂、耗材和仪器设备 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 Elisa 实验检测水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞表达 VEGF 的影响 |
| 3.2.2 HIF-1a、MMP-9、VEGFR2 的实时定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 Western Blot法检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Elisa 检测培养基上清中 VEGF 蛋白的表达 |
| 3.4.2 HIF-1a基因表达 |
| 3.4.3 MMP-9基因表达 |
| 3.4.4 Western Blot 检测各组 PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达 |
| 3.4.5 Western Blot 检测各组 HIF-1a 和 MMP-9 蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 VEGF、HIF-1a和 MMP-9 在肿瘤生成中的作用 |
| 3.5.2 PI3K/AKT信号通路在肿瘤疾病中的作用 |
| 3.5.3 水蛭素通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9 因子抑制RB细胞 |
| 第四部分 水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响 |
| 4.1 实验细胞、试剂和仪器设备 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性的影响 |
| 4.2.2 RT- PCR 检测 VEGF 和 VEGFR2 基因表达 |
| 4.2.3 Western Blot法检测VEGF、VEGFR2 的蛋白表达 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性及抑制率的影响 |
| 4.4.2 VEGFR2基因表达 |
| 4.4.3 VEGF基因表达 |
| 4.4.4 水蛭提取液对 HUVEC 细胞表达 VEGF 和 VEGFR2 蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 VEGF和 VEGFR2对血管生成的调控 |
| 4.5.2 水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和 VEGFR2的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件 1 文献综述 水蛭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 文献综述 视网膜母细胞瘤的生物标志物 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件4 倒置显微镜下细胞形态 |
（5）转录因子Delta5 Stat5a对人类乳腺癌细胞转录组的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 专有名词中英文对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 转录因子Stat5的结构 |
| 1.2 转录因子Stat5的调控与功能 |
| 1.2.1 Stat5的活化过程 |
| 1.2.2 Stat5活性的负调控 |
| 1.2.3 Stat5与基因转录调控 |
| 1.2.4 转录因子Stat5的其他功能 |
| 1.3 转录因子Stat5与乳腺癌的关系 |
| 1.4 Stat5a的剪接变体 |
| 1.4.1 Delta5 Stat5a的发现及结构特征 |
| 1.4.2 Delta5 Stat5a的调控 |
| 1.5 本研究的目的、意义和创新 |
| 1.5.1 本研究的目的和意义 |
| 1.5.2 本研究的创新 |
| 第2章 FL Stat5a与Delta5 Stat5a稳转乳腺癌MCF-7 细胞株构建与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 扩增引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 慢病毒载体构建与鉴定 |
| 2.2.2 慢病毒包装 |
| 2.2.3 稳转细胞筛选和PCR鉴定 |
| 2.2.4 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 含目的基因FL Stat5a、Delta5 Stat5a的载体构建 |
| 2.3.2 慢病毒包装 |
| 2.3.3 稳转细胞鉴定 |
| 2.3.4 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 关于慢病毒介导的基因转移及转染效率 |
| 2.4.2 Delta5 Stat5a促进乳腺癌细胞的增殖 |
| 第3章 FL Stat5a和Delta5 Stat5a对乳腺癌细胞基因表达的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 软件 |
| 3.1.5 基因比对文库 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验流程 |
| 3.2.2 信息分析流程 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 三组样本有效reads数 |
| 3.3.2 链特异性建库测序结果 |
| 3.3.3 三组样本reads分布情况 |
| 3.3.4 转录本覆盖具均一性 |
| 3.3.5 测序有效数据量充足 |
| 3.3.6 基因表达量整体水平 |
| 3.3.7 基因表达差异 |
| 3.3.8 差异基因生物通路富集情况 |
| 3.3.9 差异基因GO分析结果 |
| 3.3.10 样品间相关性分析 |
| 3.3.11 样品间主成分分析 |
| 3.3.12 转录本表达整体水平 |
| 3.3.13 已知m RNA的表达 |
| 3.3.14 已知m RNA表达差异 |
| 3.3.15 已知ncRNA的表达 |
| 3.3.16 已知ncRNA表达差异 |
| 3.3.17 ncRNA靶基因预测 |
| 3.3.18 靶基因(目的基因)生物通路富集情况 |
| 3.3.19 靶基因GO分析结果 |
| 3.3.20 新lncRNA预测 |
| 3.3.21 新lncRNA表达差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于实验设计与数据分析 |
| 3.4.2 FL Stat5a、Delta5 Stat5a差异表达m RNA |
| 3.4.3 FL Stat5a、Delta5 Stat5a差异表达ncRNA |
| 3.4.4 与乳腺癌相关的靶基因富集通路 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录A FL Stat5a与Delta5 Stat5a差异表达基因热图 |
| 附录B FL Stat5a与Delta5 Stat5a已知m RNA差异表达热图 |
| 附录C FL Stat5a与Delta5 Stat5a已知m RNA差异表达热图 |
| 附录D FL Stat5a与Delta5 Stat5a新ln RNA差异表达热图 |
| 附录E P53信号通路 |
| 附录F NF-kappa B信号 |
| 附录G 质粒图谱 |
（6）血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤血管的生成与抑制 |
| 1.1.1 肿瘤血管生长因子 |
| 1.1.1.1 血管内皮细胞生长因子 |
| 1.1.1.2 基质金属蛋白酶 |
| 1.1.1.3 成纤维细胞生长因子 |
| 1.1.2 肿瘤血管生长抑制因子 |
| 1.1.2.1 肿瘤血管抑制因子的种类 |
| 1.1.2.2 管抑制因子的作用机理 |
| 1.1.2.3 管抑制因子Kringle 5 |
| 1.1.3 血管生长因子和血管生长抑制因子的关系 |
| 1.2 蛋白受体和配体的筛选及鉴定 |
| 1.2.1 酵母双杂交筛选体系 |
| 1.2.2 噬菌体展示技术筛选体系 |
| 1.2.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 本研究的创新点 |
| 1.5 本研究拟采用的技术路线 |
| 第二章 KRINGLE 5的原核表达及分离纯化 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.4.1 Kringle 5原核表达载体的构建 |
| 2.1.4.2 Kringle 5重组蛋白的表达及分离纯化 |
| 2.1.4.3 表达产物的Tris-tricne-SDS-PAGE分析 |
| 2.1.4.4 蛋白浓度测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Kringle 5重组载体的构建 |
| 2.2.1.1 Kringle 5基因的PCR扩增 |
| 2.2.1.2 Kringle 5 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.1.3 Kringle 5 PCR产物和pET28b质粒载体的连接及双酶切鉴定 |
| 2.2.1.4 Kringle 5重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.2 重组菌种的诱导表达 |
| 2.2.2.1 重组菌E.Coli BL21(DE3)/ET28b-Kringle 5的表达 |
| 2.2.2.2 重组Kringle 5蛋白的初步分离纯化 |
| 2.2.2.3 重组Kringle 5蛋白的凝胶排阻色谱纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 噬菌体展示肽库筛选KRINGLE 5结合蛋白 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 ER2738菌体的复苏 |
| 3.1.5 噬菌体滴度测定 |
| 3.1.6 Kringle 5的包被及亲和短肽的筛选 |
| 3.1.6.1 第一轮筛选 |
| 3.1.6.2 第二轮筛选 |
| 3.1.6.3 第三轮筛选 |
| 3.1.6.4 第四轮筛选 |
| 3.1.7 淘选噬菌斑的扩增及噬菌体的提取 |
| 3.1.8 阳性噬菌体基因序列的测定 |
| 3.1.9 ELISA检测Kringle 5蛋白对筛选噬菌体的结合能力 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 噬菌体随机肽库的淘选和富集 |
| 3.2.2 筛选克隆的测序分析 |
| 3.2.3 ELISA分析筛选噬菌体单克隆与Kringle 5的亲和性 |
| 3.2.4 蛋白序列比对 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 分子对接研究KRINGLE 5蛋白与筛选蛋白的作用 |
| 引言 |
| 4.1 分子对接虚拟筛选药物的基本原理 |
| 4.2 蛋白晶体结构的构建 |
| 4.2.1 构建晶体模型结构的蛋白氨基酸序列 |
| 4.2.2 蛋白3D模型的构建 |
| 4.2.3 蛋白三维结构的评价 |
| 4.2.4 Kringle 5蛋白与蛋白的对接研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Kringle 5蛋白的晶体模型构建及评价 |
| 4.3.2 VDAC-1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.2.1 VDAC-1晶体结构模型的构建 |
| 4.3.2.2 VDAC-1与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性中心分析 |
| 4.3.3 Laminin subunit alpha-3 isoform 2 precursor与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.3.1 Laminin subunit alpha-3蛋白晶体结构模型的构建 |
| 4.3.3.2 Laminin subunit alpha-3蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.4 ATP-binding cassette sub-family A 12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接研究 |
| 4.3.4.1 ATP-binding cassette sub-family(ABCA12)蛋白晶体结构的构建 |
| 4.3.4.2 ABCA12蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.5 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.5.1 Cochlin precursor蛋白晶体模型的构建 |
| 4.3.5.2 Cochlin precursor蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.6 Transmembrane channel-like protein 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.6.1 Transmembrane channel-like protein 2蛋白三维结构的构建 |
| 4.3.6.2 Transmembrane channel-like protein 2与Kringle 5的分子对接及其活性位点分析 |
| 4.3.7 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.7.1 Endothelin B receptor isoform X2蛋白三维结构的构建 |
| 4.3.7.2 Endothelin B receptor isoform X2与Kringle 5蛋白的分子对接及活性位点分析 |
| 4.3.8 Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.8.1 Protein C-ets-2蛋白三维模型的构建 |
| 4.3.8.2 HEX软件研究Protein C-ets-2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.9 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.9.1 Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白三维模型的构建 |
| 4.3.9.2 HEX软件研究Piezo-type mechanosensitive ion channel component 2蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.10 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle 5蛋白的分子对接 |
| 4.3.10.1 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白晶体模型的构建 |
| 4.3.10.2 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 isoform 1蛋白与Kringle |
| 4.3.11 筛选蛋白与Kringle 5蛋白分子对接的自由能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 VDAC-1蛋白的克隆、表达及纯化工艺研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂与菌种 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 试剂配制 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.1.4.1 VDAC-1原核表达载体的构建 |
| 5.1.4.2 VDAC-1重组蛋白的诱导表达及分离纯化 |
| 5.1.4.3 SDS-PAGE |
| 5.1.4.4 蛋白浓度测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 VDAC-1元和表达载体的构建 |
| 5.2.1.1 VDAC-1 cDNA的PCR扩增 |
| 5.2.1.2 VDAC-1 PCR产物的胶回收 |
| 5.2.1.3 VDAC-1 PCR产物和pET28b质粒载体的双酶切 |
| 5.2.1.4 pET28b-VDAC-1重组质粒的测序鉴定 |
| 5.2.2 重组E.Co1i BL21(DE3)/pET28b-VDAC-1菌种的诱导表达 |
| 5.2.3 重组VDAC-1蛋白的分离纯化 |
| 5.2.3.1 重组VDAC-1蛋白的复性后分离 |
| 5.2.3.2 重组VDAC-1蛋白的柱上复性 |
| 5.2.3.3 两种分离纯化条件对VDAC-1蛋白纯化效率的影响 |
| 5.2.4 不同复性条件对VDAC-1蛋白产率的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 SPR和前沿色谱法验证KRINGLE 5与VDAC-1相互作用 |
| 引言 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器及耗材 |
| 6.1.2.1 实验仪器 |
| 6.1.2.2 实验耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 SPR研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 |
| 6.2.1.1 Kringle 5蛋白固定化最佳条件的确定 |
| 6.2.1.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片上的偶联 |
| 6.2.1.3 Kringle 5与VDAC-1蛋白的结合实验 |
| 6.2.1.4 VDAC-1与Kringle 5蛋白亲和热力学分析 |
| 6.2.1.5 芯片的再生 |
| 6.2.2 前沿色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1互作 |
| 6.2.2.1 固定化Kringle 5蛋白的硅胶填料的制备 |
| 6.2.2.2 定向固定化Kringle 5蛋白与VDAC-1受体蛋白的相互作用 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 SPR研究Kringle 5蛋白与筛选蛋白的相互作用 |
| 6.3.2 SPR研究VDAC-1与Kringle 5的互作 |
| 6.3.2.1 Kringle 5蛋白在CM芯片表面偶联条件的优化 |
| 6.3.2.2 Kringle 5蛋白在CM5芯片表面的偶联 |
| 6.3.2.3 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的结合分析 |
| 6.3.2.4 Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的热力学分析 |
| 6.3.2.5 CM5芯片的再生及再生次数的研究 |
| 6.3.3 前沿色谱研究VDAC-1与Kringle 5的相互作用 |
| 6.3.3.1 前言色谱法研究Kringle 5蛋白与VDAC-1蛋白的相互作用 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究（论文提纲范文）
| 缩略语中英文对照一览表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 国内外研究现状 |
| 1.4 研究的内容与方法 |
| 2 Sjcystatin重组蛋白的制备及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 rSjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预效果 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 rSjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 综述 |
| 参考文献 |
| 8 攻博期间公开发表的科研成果 |
| 9 后记 |
（8）组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 研究背景及文献综述 |
| 1.1 心脏的主要进化类型 |
| 1.1.1 管状心脏 |
| 1.1.2 环形心脏 |
| 1.1.3 两腔室心脏 |
| 1.1.4 三腔室心脏 |
| 1.1.5 四腔室心脏 |
| 1.2 血管形成的机制 |
| 1.2.1 血管形成的主要调节因子及其作用 |
| 1.2.2 血管壁基质在血管形成中的作用 |
| 1.2.3 蛋白水解酶系统在血管形成中的作用 |
| 1.3 人类心脏及血管的研究历史 |
| 1.3.1 人类心脏及血管研究的经验学时期 |
| 1.3.2 人类心脏及血管研究的生理学时期 |
| 1.3.3 人类心脏及血管研究的分子生物学时期 |
| 1.4 模式动物与人类心脏及血管发育的研究 |
| 1.4.1 心脏发育的先驱模型——果蝇 |
| 1.4.2 两腔室心脏的代表模型——斑马鱼 |
| 1.4.3 三腔室心脏的代表模型——爪蟾 |
| 1.4.4 经典遗传学研究中的重要模型——鸡 |
| 1.4.5 四腔室心脏的代表模型——小鼠 |
| 1.5 组蛋白与组蛋白修饰调节 |
| 1.5.1 组蛋白的甲基化修饰 |
| 1.5.2 组蛋白的乙酰化修饰 |
| 1.5.3 组蛋白的磷酸化修饰 |
| 1.5.4 组蛋白的泛素化修饰 |
| 1.5.5 组蛋白的SUMO化修饰 |
| 1.5.6 组蛋白的其它修饰方式 |
| 1.6 本研究的研究目的及意义 |
| 1.7 参考文献 |
| 第2章 SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究 |
| 2.1 SMYD蛋白家族概述 |
| 2.1.1 SMYD1--心脏和骨骼肌发育的调节因子 |
| 2.1.2 SMYD2--赖氨酸甲基化转移酶和肿瘤抑制因子的调控子 |
| 2.1.3 SMYD3--转录调控和肿瘤生成 |
| 2.1.4 SMYD4和SMYD5 |
| 2.1.5 关于SMYD1的前期研究基础 |
| 2.2 本研究的研究目的及意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SMYD1在血管内皮细胞中的表达 |
| 2.4.2 沉默SMYD1将影响血管内皮细胞的迁移和细胞管状结构的形成 |
| 2.4.3 SMYD1在体内和体外与SRF相互作用 |
| 2.4.4 SMYD1与SRF形成复合物、增强SRF的DNA结合活性 |
| 2.4.5 SMYD1在P19细胞分化过程中与Nkx2.5具有表达的相关性 |
| 2.4.6 SMYD1启动子上的Nkx2.5结合位点分析 |
| 2.4.7 Nkx2.5的共同作用因子可以调控SMYD1的表达 |
| 2.4.8 SMYD1与Nkx2.5相互作用 |
| 2.4.9 SMYD1与Nkx2.5协同调节Nkx2.5下游基因的表达 |
| 2.4.10 SMYD1蛋白不能与Nkx2.5和DNA形成三元复合体 |
| 2.4.11 转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第3章 其它工作(1):基因敲除打靶载体的快速构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 基因敲除技术概述 |
| 3.1.2 条件性基因敲除技术概述 |
| 3.1.3 G蛋白偶联受体概述 |
| 3.2 本研究的研究目的及意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GPR126条件性基因敲除打靶载体同源臂的设计 |
| 3.4.2 GPR126-BAC中Red重组系统的转入 |
| 3.4.3 亚克隆目的片段至pStart-K载体的鉴定 |
| 3.4.4 引入第一个LoxP位点 |
| 3.4.5 载体自连成功后的酶切鉴定 |
| 3.4.6 引入第二个LoxP位点 |
| 3.4.7 引入neo阳性选择标记基因 |
| 3.4.8 LoxP及FRT功能元件的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第4章 其它工作(2):神经轴突导向因子netrin-G2的克隆与研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 本研究的研究目的及意义 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 人netrin-G2的cDNA克隆及生物信息学分析 |
| 4.4.2 人netrin-G2与netrin家族其它成员的同源性分析 |
| 4.4.3 人netrin-G2的Northern杂交分析 |
| 4.4.4 人netrin-G2蛋白的末端信号肽分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 参考文献 |
| 第5章 结语 |
| 附录一 攻读博士学位期间发表的论文及主要科研课题 |
| 附录二 专业名词缩写词简表 |
| 致谢 |
（9）黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 前言 |
| 第一节 菇类的抗氧化活性 |
| 1.1.1 菇类抗氧化活性研究概况 |
| 1.1.2 黄伞的研究情况 |
| 第二节 氧化还原水平与NF-κB信号途径 |
| 1.2.1 氧自由基与氧化损伤 |
| 1.2.2 抗氧化剂 |
| 1.2.3 抗氧化活性检测方法 |
| 1.2.4 NF-κB信号途径在氧化应激中的作用 |
| 第三节 HIV-1与抗艾滋病药物 |
| 1.3.1 艾滋病及HIV的分子生物学 |
| 1.3.2 抗艾滋病靶点及药物研究现况 |
| 第四节 选题依据与研究意义 |
| 1.4.1 抗氧化与抗HIV-1之间的关系 |
| 1.4.2 抗氧化、抗HIV-1活性成分筛选模型 |
| 1.4.3 黄伞中天然活性成分的多效性 第二章 黄伞中活性物质的分离纯化及结构分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 64株大型真菌的抗氧化活性测定及实验菌株的选择 |
| 2.3.2 黄伞中活性成分的提取途径和方法 |
| 2.3.3 黄伞中小分子活性物质的分离纯化 |
| 2.3.4 黄伞子实体中活性物质的结构鉴定 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 2.4.1 抗氧化活性的检测方法 |
| 2.4.2 黄伞子实体中活性成分的有效提取 |
| 2.4.3 黄伞子实体中活性物质的分析 第三章 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 表达具有氧化还原敏感性质GFP的基因工程大肠杆菌的构建 |
| 3.3.2 胞内抗氧化筛选模型E.coli BL21(pET-croGFP)的应用 |
| 3.3.3 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 3.3.4 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的应用 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 3.4.1 抗氧化成分筛选模型的比较 |
| 3.4.2 胞内抗氧化活性成分筛选模型的构建与应用 |
| 3.4.3 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建与应用 |
| 3.4.4 黄伞中成分抗氧化与抗HIV-1活性之间的关系 |
| 3.4.5 天然活性成分的毒性评价 第四章 黄伞中抗氧化活性成分的抗HIV-1作用机制的研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.3.2 黄伞子实体活性成分的抗HIV-1作用机制 |
| 4.3.3 黄伞活性成分对SOD酶和细胞因子表达水平的影响 |
| 第四节 分析讨论 |
| 4.4.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.4.2 黄伞活性成分抗HIV-1作用靶点分析 |
| 4.4.3 活性成分对细胞因子表达的调节作用 第五章 结论与展望 |
| 第一节 结论 |
| 第二节 展望 参考文献 致谢 个人简历 |
四、重组血管生成抑制因子r-K4K5的分离纯化与功能鉴定（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]人层粘连蛋白α3链LG1结构域是人纤溶酶原Kringle5在内皮细胞表面的一个受体[D]. 张椰莉. 西北大学, 2020
- [3]红麻蛋白乙酰化修饰调控细胞质雄性不育及相关功能研究[D]. 韦范. 广西大学, 2020
- [4]水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究[D]. 李园媛. 成都中医药大学, 2020(01)
- [5]转录因子Delta5 Stat5a对人类乳腺癌细胞转录组的影响[D]. 唐海欧. 吉首大学, 2019(02)
- [6]血管抑制因子Kringle 5体内结合蛋白的筛选及其相互作用研究[D]. 梁引库. 西北大学, 2016(04)
- [7]重组Sjcystatin对小鼠不明原因复发性流产的干预研究[D]. 熊员焕. 武汉大学, 2015(07)
- [8]组蛋白甲基化转移酶SMYD1在心肌分化与血管发生中的功能研究[D]. 叶湘漓. 湖南师范大学, 2013(03)
- [9]黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究[D]. 王常荣. 南开大学, 2013(06)
- [10]具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化[J]. 黄莉钧,石丁波,姚亚超,李磊,戴智育,张婷,高国全,杨霞. 热带医学杂志, 2013(02)