一、慢性肝病发病机制的基础研究有待深入（论文文献综述）
侯丽爽[1]（2021）在《芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究》文中研究指明目的:肝纤维化一种结缔组织异常增生的病理过程,伴随胶原蛋白大量合成及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积。诱因主要包括酒精、药物、代谢紊乱、病毒感染、免疫性肝炎和胆汁淤积等。在世界范围内,肝纤维化引起的肝硬化和肝癌,是肝病发病率和死亡率的主要原因。肝病的发病率逐年增加,使我国成为肝病大国,严重损害人民健康,加重社会负担。目前的疗法,包含药物及纤维源性标记物等技术。但需要结合大量临床评估,才能确保其有效性。化学合成药物在改善病毒性肝炎方面已有临床报道,但对纤维结缔组织的增生,仍缺乏针对性。中药组分或有效成分,在抗肝纤维化方面展现明显优势。课题组发现天然植物芝麻,具有抗炎抗氧化药理活性,推测可能对肝病有改善作用。为此,选择其主要活性成分芝麻素和芝麻酚,验证对肝纤维化的改善作用。由于芝麻素和芝麻酚在抗肝纤维化中的作用机制仍然不明确,制约了新药的开发与应用。因此,本研究开展了芝麻素和芝麻酚在体内外抗肝纤维化的研究,解析抗肝纤维化的机制,为肝纤维化的临床治疗提供药理学参考,并为新药的研发提供理论基础。芝麻素（sesamin,SES）和芝麻酚（sesamol,DER）是一种天然的木酚素类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。但对肝纤维化的干预效果还不明确。因此,本课题主要研究SES和DER改善肝纤维化的相关机制。具体为:SES如何调节法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和小异二聚体伴侣（short heterodimer partner,SHP）,在体内外干预炎症及肝纤维化;DER介导FXR/肝X受体（liver X receptor,LXR）信号调控硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）或雷帕霉素（rapamycin,RA）诱导的肝损伤、炎症、自噬及肝纤维化的机制研究;DER抑制大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells-T6,HSC-T6）的活化,调控FXR/LXR信号串扰,参与THP-1巨噬细胞及人肝星状细胞（LX-2）的交互,抑制肝星状细胞活化。方法:（1）在SES改善TAA诱导的肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,分为6组:正常组、TAA组、TAA和SES（20 mg/kg）组、TAA和SES（40mg/kg）组、TAA和Curcumin（Cur）（20 mg/kg）组以及单独的SES组。除正常组和单独SES组,其他组小鼠腹膜内注射TAA连续5周,第1周每周3次100 mg/kg,第2至5周每周两次200 mg/kg。此外,在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行SES或Cur治疗。同时,正常组和TAA组施用等量生理盐水4周。在实验结束后,首先检测血清生化指标谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）水平。使用天狼星红染色（Sirius Red）,三色胶原染色（Masson）及苏木精-伊红染色法（H&E）,检查肝脏组织病理学变化。通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色,检测相应抗体的表达。最后,采用蛋白印记与实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription PCR,q RTPCR）结合的方式,检测纤维化及炎症的水平。在体外,先用TGF-β激活HSCs2h,然后给予SES（3.125,6.25,12.5μM）,FXR的激动剂GW4064（2μM）或FXR的抑制剂Gugglusterone（50μM）处理2h。通过免疫荧光,蛋白印记,q RT-PCR等方法,检测FXR,SHP,α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,核苷酸结合域-（NOD-）样受体蛋白3（nucleotide-binding domain-（NOD-）like receptor protein 3,NLRP3）,白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）,白介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）等蛋白的表达情况。采用特异性基因阻断FXR（si FXR）和SHP（si SHP）转染HSCs,通过蛋白印记和q RT-PCR检测相关蛋白的表达。（2）在DER改善TAA诱发肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,随机分为6组:正常组、TAA组、TAA和DER（10 mg/kg）组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和Cur（20 mg/kg）组,及单独的DER（20 mg/kg）组。TAA给药方式同SES。在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行DER（10、20 mg/kg）治疗。同时,正常组、TAA组小鼠,给予等量生理盐水4周。在自噬诱导肝纤维化的模型中,将鼠随机分为5组:正常组、TAA组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和RA（2 mg/kg）组、TAA和3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）（10 mg/kg）组。TAA组的给药方式同SES。从第2至5周,除正常组和TAA组,另外二组每周3次腹腔注射RA或3-MA。实验结束后,检测血清生化指标及组织病理学变化。采用蛋白印记与荧光定量逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）、q RT-PCR的方法,测定纤维化指标和炎症因子的表达。体外模型,先用TGF-β激活HSCs,然后给予DER（3.125,6.25,12.5μM）进行处理,检测FXR,LXRα/β,微管相关蛋白轻链3α/β（Microtubule-associated protein light chain 3α/β,MAPLC3α/β）和泛素结合蛋白自噬受体（Sequestosome 1,SQSTM1/P62）等相关蛋白的表达。利用转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）激活HSCs后,联合RA和3-MA,给予DER作用后,检测了相关蛋白的表达。另外,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（0-100 ng/ml）刺激THP-1细胞,收集上清液LPS条件培养基,联合RA激活LX-2细胞。给予DER或3-MA孵育后,检测自噬蛋白及炎症蛋白的表达。用FXR激动剂GW4064,LXR激动剂GW3965及DER处理LX-2细胞,通过RT-PCR及细胞荧光,检测自噬蛋白,α-SMA及炎症相关的蛋白表达。结果:（1）SES显着降低了的ALT、AST水平,改善了TAA导致的组织病理学变化。明显抑制了α-SMA、I型胶原（type I collagen,collagen-I）、金属蛋白酶-1的组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）/基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP13）等纤维化相关标志蛋白及炎症细胞因子的浸润,并上调了FXR、SHP的表达。体外结果显示,SES能明显抑制由TGF-β刺激引起的纤维化标志蛋白的表达。通过蛋白印记,q RT-PCR,细胞免疫荧光方法,证实了SES对NLRP3、caspase-1和IL-1β等炎症因子的调控作用。SES和FXR的激动剂GW4064都能明显提高FXR、SHP的表达,下调α-SMA、IL-1α和IL-6的表达。（2）DER显着降低了TAA引起的血清生化指标ALT、AST水平,改善了组织病理学变化,明显抑制了纤维化标志蛋白及自噬蛋白的表达。DER还下调了炎症细胞因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1）和IL-6等的表达并抑制NLRP3炎性小体的激活。DER与自噬抑制剂3-MA具有相同的功效,显着下调了ALT、AST水平,改善了TAA或RA导致的组织病理学变化。体外结果显示,DER明显抑制了由TGF-β刺激引起的HSCs中纤维化标志蛋白及炎症细胞因子的表达。DER处理后,逆转了TGF-β激活HSCs引起的FXR和LXRα/β蛋白表达的下调。使用TGF-β和RA联合刺激HSCs,DER和3-MA功能相似,抑制了自噬蛋白和炎症细胞因子的释放。收集LPS刺激THP-1细胞的上清液孵育LX-2细胞,DER和3-MA抑制了自噬蛋白、α-SMA和炎症细胞因子的表达。DER通过基因阻断自噬相关蛋白（autophagy Related Protein 7,ATG7）（si ATG7）同样抑制了LPS条件培养基引起LX-2细胞的活化。此外,DER同GW4064或GW3965功能相似,上调了LX-2细胞中FXR和LXR的表达,抑制了自噬蛋白及NLRP3炎症小体的活化。基因沉默FXR（si FXR）和LXR（si LXR）后,DER或3-MA同样抑制了LX-2细胞的活化。结论:（1）SES通过介导FXR/SHP信号通路,抑制了NLRP3炎症小体的活化及炎症细胞因子的表达,减少ECM的沉积及HSCs的活化。通过基因沉默FXR及SHP,验证了FXR和SHP的相互调控作用,并且,SES充当FXR的激动剂,激活FXR及SHP的表达。此外,SES保护肝脏免受TAA毒性的影响,防止胶原蛋白的累积,减少炎症因子对肝脏的损害及组织病理学的变化,改善了肝纤维化。（2）DER通过靶向FXR/LXR信号,参与LX-2细胞和THP-1细胞的交互,抑制LX-2细胞的自噬反应、减少NLRP3炎症小体的活化、caspase-1的裂解及炎症细胞因子IL-1β的产生。DER的作用同3-MA,抑制了HSCs的激活及自噬,降低了TAA引起的纤维化标志蛋白的表达,改善组织病理学的变化,减少NLRP3及炎症因子的浸润,抑制了肝纤维化的发展。此外,DER同3-MA都能抑制肝脏自噬反应,缓解RA引起的自噬对肝脏的损害,减少肝脏炎症及组织病理的改变,发挥肝保护的作用。总之,本研究证实了天然的木酚素类化合物SES和DER,参与FXR/SHP/LXR信号交互,具有改善肝纤维化和抑制炎症的良好功效,防止TAA及自噬对肝脏造成的损伤。DER通过调控巨噬细胞与HSCs细胞间的串扰,发挥改善肝纤维化的作用。SES和DER可作为改善肝纤维化的理想调节剂,并具备天然药物独特的生物活性优势。未来,我们在SES和DER的药代动力学,生物利用度及安全性评价等方面,将会做更多的应用及研究,为临床开发安全、有效、创新的抗肝纤维化药物,奠定良好的理论基础。
杨晶晶[2]（2021）在《DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制》文中提出研究背景肝纤维化（Liver fibrosis）是各种损伤因素引发的持续性损伤修复反应,导致肝组织内细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的异常沉积,进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。目前临床上肝纤维化的治疗效果不佳,严重危害人类的生命健康。因此,阐明肝纤维化的发病机制,具有重要临床意义。研究证实,活化的肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）是肝脏合成ECM的主要细胞,肝星状细胞活化增殖是肝纤维化形成的中心环节。在各种损伤刺激下,HSCs由静止的、储存维生素A的细胞向增生的、成纤维的肌成纤维细胞的转分化,并分泌α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、I型胶原（Collagen I,Col1a1）等,产生促纤维化的细胞因子如转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）等现已被公认为肝纤维化的主要驱动因素。然而,到目前为止,关于调控HSCs增殖和肝纤维化发病的分子机制不详,因此,探究肝纤维化发病过程中HSCs增殖的分子作用机制对预防和治疗肝纤维化意义重大。各种因素参与调控HSCs增殖,表观遗传修饰DNA甲基化是重要的表观遗传标记,在肝纤维化形成过程中起关键作用。本课题组研究发现DNA甲基化参与调控HSCs增殖,但是作为DNA甲基化转移酶之一的DNMT3A在肝纤维化的发病过程中起着怎样的调控作用,仍不明确。此外,研究表明,表观遗传学修饰长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）具有调控HSCs增殖的作用,INK4基因座中反义非编码RNA（Antisense Non-Coding RNA in the INK4 Locus,ANRIL）是已知的具有调控细胞活化增殖功能的关键分子之一。文献报道Lnc RNA ANRIL可通过介导细胞增殖通路相关蛋白的表达调控细胞增殖活性。但是,关于Lnc RNA ANRIL如何调控HSCs增殖的具体分子机制不清,有待阐明。基于DNMT3A与Lnc RNA ANRIL两种表观遗传修饰方式如何调控HSCs增殖,两者之间相互作用、作用靶点和调控方式,需要深入阐明。本文将探究DNMT3A介导Lnc RNAANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制,以期为临床肝纤维化的治疗提供科学依据、新的分子诊断指标和干预靶点。本研究收集临床肝纤维化患者血清及组织标本,并采用经典的四氯化碳（CCl4）皮下注射建立小鼠肝纤维化模型为体内研究对象,以肝星状细胞HSCs为体外研究对象,应用荧光原位杂交、甲基化特异性PCR（MSP）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）荧光染色等技术,进行DNMT3A介导Lnc RNA ANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制研究。全文共分三个部分:第一部分临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达目的:阐明DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I在临床患者肝纤维化样本中的差异表达。方法:选取安徽医科大学第二附属医院肝胆外科慢性肝病患者20例。所有患者均签署剩余标本使用知情同意书。分组:根据肝穿刺活检病理学诊断有无合并纤维化症状分为对照组（无纤维化组）和纤维化组各10例,肝穿刺活检病理学诊断参照《肝纤维化诊断及治疗共识（2019）》。并记录患者的相关信息,如年龄、性别等,严格按照安徽医科大学生物医学伦理委员会要求执行,收集血清及肝组织样本待测。（1）检测肝纤维化患者血清中AST、ALT、HA的含量变化;（2）HE染色观察肝纤维化患者肝脏组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察肝纤维化患者肝脏组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、肝纤维化标志蛋白α-SMA、Collagen I在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达。结果:1.临床患者肝纤维化组织中DNMT3A表达显着升高,ANRIL表达明显降低（1）肝纤维化组血清中AST/ALT比值、HA的含量与对照组相比明显增加;（2）与对照组相比,肝纤维化组肝组织中胶原沉积明显增多、炎性浸润增加,纤维化改变显着;（3）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白的表达较对照组显着增高;（4）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I m RNA的表达较对照组显着增高,而ANRIL m RNA的表达则显着降低。（5）相关性Preason分析结果显示:肝纤维化患者组织中DNMT3A和α-SMA的相对表达呈现明显正相关,ANRIL和α-SMA的相对表达呈现明显负相关。小结:DNMT3A高表达与ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化患者纤维化形成有关。第二部分小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平目的进一步阐明小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平。方法1.30只雄性小鼠（18～22g）随机分为2组:正常组15只、CCl4处理组15只。自处理之日开始,除正常组给予橄榄油（1 ml/kg）皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;直至第12周结束,建模过程中注意观察并记录小鼠体重变化,于造模满12周时,麻醉后留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）检测肝纤维化小鼠血清中AST、ALT、HA、TGF-β1的含量变化;（2）HE染色观察小鼠肝纤维化组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达;（6）FISH检测ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达;（7）MSP检测小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平。2.体外以肝星状细胞HSCs为研究对象,使用细胞因子TGF-β1（5ng/ml）诱导刺激HSCs增殖,建立体外HSCs增殖模型,进行以下实验:（1）检测TGF-β1处理HSCs后上清液中HA和PIIIP的含量变化;（2）Western blotting及免疫荧光实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（3）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（4）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察TGF-β1处理对HSCs增殖的影响;（5）BSP检测TGF-β1处理HSCs后ANRIL启动子区域甲基化位点变化。结果:1.小鼠肝纤维化组织中DNMT3A表达显着增高,ANRIL表达显着降低,ANRIL表达降低可能与ANRIL基因启动子区域甲基化水平升高有关。（1）肝纤维化小鼠血清中AST/ALT比值、HA、TGF-β1含量水平较对照组明显增高;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在小鼠肝纤维化组织中显着增高,而ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低;（4）小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平与对照组相比显着升高。2.体外HSCs增殖模型中,DNMT3A高表达,ANRIL低表达,ANRIL的低表达可能与ANRIL启动子区域甲基化水平升高有关（1）TGF-β1处理后HSCs细胞上清液中HA和PIIIP的含量较对照组明显增高;（2）与对照组相比,TGF-β1诱导刺激HSCs（24h、48h）后HSCs增殖活性明显增强;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在TGF-β1诱导刺激HSCs中显着增高,而ANRIL m RNA的表达显着降低;（4）同时,TGF-β1诱导刺激HSCs中ANRIL启动子区域甲基化水平较对照组显着升高。小结:DNMT3A高表达与ANRIL高甲基化修饰导致的ANRIL表达下调,可能与小鼠肝纤维化形成和HSCs增殖有关。但是关于DNMT3A与ANRIL如何调控肝纤维化形成和HSCs增殖,两者之间有何调控作用,仍不清楚,值得进一步研究。第三部分DNMT3A介导ANRIL甲基化在肝纤维化与HSCs增殖中的分子作用机制目的:探究DNMT3A介导ANRIL甲基化调控HSCs细胞增殖及肝纤维化的分子机制。方法:1.60只雄性小鼠（18～22g）随机分为4组:正常组,CCl4处理组,CCl4+LV3慢病毒空载体组,CCl4+LV3-DNMT3A慢病毒组,每组各15只。自处理之日开始,除正常组给予（1 ml/kg）剂量橄榄油皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;于造模满11周后,LV3慢病毒空载体组小鼠,LV3-DNMT3A慢病毒组小鼠,分别给予30μl慢病毒空载体LV3和30μl慢病毒LV3-DNMT3A尾静脉注射处理（慢病毒颗粒的滴度为1×109TU/ml）,一周后处死小鼠,留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）HE染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织病理学改变;（2）Masson染色及天狼猩红染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（3）Western blotting及免疫组织化学实验检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（4）RT-qPCR检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（5）FISH检测重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达变化。2.细胞实验:应用DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及DNA甲基转移酶抑制剂2’-脱氧-5-氮杂胞嘧啶（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Azad C）1μmol/L分别转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A过表达质粒处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A小干扰RNA处理组,TGF-β1（5ng/ml）+5-Azad C（1μmol/L）处理组,并进行以下实验:（1）Western blotting检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（2）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）处理后对HSCs增殖的影响。3.应用ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL过表达质粒处理组、TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL小干扰RNA处理组;并进行以下实验:（1）Western blotting检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中α-SMA、Collagen I、AMPK、Phospho-AMPK（p-AMPK）蛋白的表达变化;（2）RT-qPCR检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色观察ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA对HSCs增殖的影响。结果:1.重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL的表达明显升高,小鼠肝纤维化程度明显改善（1）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,肝脏细胞结构改善、胶原纤维减少,肝组织纤维化病理改善更为明显;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达显着增高,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达明显减少;（3）然而,与对照组相比,ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中ANRIL m RNA的表达明显升高。2.体外HSCs增殖模型中,过表达DNMT3A可显着抑制ANRIL表达,促进HSCs增殖;而沉默DNMT3A可明显促进ANRIL表达,抑制HSCs增殖;提示DNMT3A通过负调控ANRIL的表达影响HSCs增殖活性（1）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA处理后HSCs中DNMT3A m RNA表达显着降低,而ANRIL m RNA表达显着增高。（2）然而,与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs中DNMT3A m RNA表达明显增高,而ANRIL m RNA表达明显降低。（3）与TGF-β1刺激组相比,使用DNA甲基化抑制剂5-Azad C处理HSCs后ANRIL表达水平明显升高。（4）与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs增殖活性明显增强;（5）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA后可明显抑制HSCs增殖;此外,与TGF-β1刺激组相比,5-Azad C处理后可明显抑制HSCs增殖。3.过表达ANRIL能明显抑制AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着降低HSCs的增殖活性;沉默ANRIL可显着增加AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着促进HSCs的增殖活性;（1）与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染HSCs后ANRIL表达显着升高,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显降低;（2）另外,与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染后明显抑制HSCs增殖。（3）然而,与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染HSCs后ANRIL表达显着降低,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显增高;（4）与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染后明显促进HSCs增殖。小结:Lnc RNAANRIL可能因DNMT3A介导的高水平甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。结论:1.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化形成有关。2.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRL发生高甲基化修饰导致ANRIL表达下调,可能与肝纤维化形成和HSCs增殖有关。3.LncRNA ANRIL可能因DNMT3A介导的高甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。
廖媛[3]（2020）在《基于MAPK-ERK-TLRs通路探讨脂必泰对非酒精性脂肪性肝病的作用机制及临床疗效研究》文中认为研究背景:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）是一种与胰岛素抵抗及遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤。疾病谱包括非酒精性肝脂肪变（Nonalcoholic Hepatic Steatosis）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH）及其相关的肝硬化和肝细胞癌。NAFLD是全球流行的主要肝脏疾病之一,是当代医学领域的新挑战,其对人类健康的危害仍将不断扩大。目前,临床上国内外尚无针对NAFLD的特效药品。中药现代化启发我们充分利用我国现有丰富的中药资源宝库,选择开发合理的原药材或原有方剂,从中寻找既能改善胰岛素抵抗又能保肝抗炎的治疗NAFLD的有效药物成为当务之急。本研究共分为两部分,基础研究部分和临床研究部分。基础研究部分通过高脂高糖诱导非酒精性脂肪性肝病动物模型,探讨脂必泰干预NAFLD的作用效果,及对MAPK-ERK-TLRs信号通路的影响,为脂必泰应用于临床治疗NAFLD提供实验依据。临床研究部分通过脂必泰治疗NAFLD患者,观察脂必泰对患者肝脏硬度（LSM）、脂肪衰减（CAP）、体重、身体质量指数（BMI）的影响,及对肝功、血脂、血糖、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）等指标的改善情况,综合评价脂必泰对NAFLD患者的治疗效果。基础研究部分目的:建立大鼠非酒精性脂肪肝疾病模型,观察脂必泰在疾病动物模型中治疗非酒精性脂肪性肝病的作用效果及机制研究。方法:实验选取6周龄雄性SD大鼠,采用10%果糖和高脂饲料诱导伴有IR的非酒精性脂肪肝病大鼠模型,模型验证成功后,将模型大鼠随机分为模型对照组,脂必泰低剂量组（100 mg/kg/day）,脂必泰高剂量组（200 mg/kg/day）,二甲双胍组（200mg/kg/day）,水飞蓟宾组（100 mg/kg/day）,另设正常对照组。给药期间,监测动物体重变化。连续给药9周后,检测各组大鼠空腹血糖（FBG）、餐后2小时血糖（2h BG）及血清胰岛素（Fins）水平,并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）;检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平;检测血清透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原（IV-C）和III型前胶原（PC-Ⅲ）水平,并计算称量肝脏重量,计算肝脏指数;采用HE染色观察肝脏组织病理结构变化;采用油红O染色观察肝脏组织冰冻切片脂滴沉积情况;采用masson染色观察肝脏组织纤维化程度。q PCR和蛋白免疫印迹法（Western bolt）检测肝组织TLR4、P-ERK1/2 m RNA水平和蛋白水平。结果:与空白对照组比较,模型对照组2h BG、Fins、HOMA-IR、ALT、AST、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、HA、LN、IV-C、PC-Ⅲ、肝脏指数及病理评分均明显升高,HDL-C明显降低,且明显上调TLR4、P-ERK1/2 m RNA和蛋白表达水平。与模型对照组比较,脂必泰低、高剂量组2h BG、Fins、HOMA-IR、ALT、AST、TG、CHOL、LDL-C、肝脏指数和组织病理评分均明显降低,HDL-C和AST/ALT明显升高,明显下调TLR4、P-ERK1/2 m RNA和蛋白表达水平。与模型对照组比较,HE染色、油红染色和Masson染色显示脂必泰低、高剂量组肝脏组织病变改善和肝纤维化程度减轻。脂必泰高、低剂量组均可下调模型动物血清HA、LN、IV-C、PC-Ⅲ和肝组织中胶原纤维表达。结论:脂必泰可通过下调TLR4、P-ERK1/2蛋白的表达,影响MAPK-ERK-TLRs通路而抑制炎症信号通路的转导,阻止炎症的发生、发展,降低血脂水平,同时拮抗胰岛素抵抗,改善肝脏空泡变性,减轻肝纤维化程度,减轻肝脏炎症反应而起到保护肝脏的作用。脂必泰可明显降低血清纤维化标记物水平和肝组织胶原纤维水平,对非酒精性脂肪性肝病起到治疗作用。临床研究部分目的:综合评价脂必泰对非酒精性脂肪性肝病患者的临床治疗作用,为脂必泰临床应用于NAFLD提供参考。方法:试验采取前瞻性研究方法,对2019.1-2019.12在广州市中医医院门诊就诊,符合痰瘀互结证的75例NAFLD患者为研究对象,将患者随机分成2组,对照组（基础治疗组）37例,试验组（脂必泰组）38例。试验过程中脱落9例患者,实际有效病例数66例,试验组33例,对照组33例。对照组患者仅控制饮食、加强运动,试验组患者在控制饮食、加强运动的基础上,给予脂必泰胶囊,每次1粒（0.24g）,每天2次,12周为一疗程。观察治疗前后两组患者肝脏脂肪衰减值（CAP）、肝脏硬度值（LSM）、体重、BMI指数、肝功（ALT、AST、GGT、ALP）、血脂（CHOL、TG、LDL-C、HDL-C）、血糖（GLU、Ins、Hb A1c）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的改善情况。临床试验以肝脏CAP值、LSM值、体重、BMI指数为主要疗效指标,以肝功、血脂、血糖和HOMA-IR为次要疗效指标进行评价。结果:与治疗前比较,对照组治疗后患者体重、BMI、LSM和CAP有统计学意义的降低（P<0.05）,其它检测指标未见明显变化;试验组治疗后患者体重、BMI、LSM、CAP、ALT、AST、GGT、GLU、Ins、HOMA-IR、CHOL和LDL-C有统计学意义的降低（P<0.05）,其它检测指标未见明显变化。与对照组治疗前相比较,试验组治疗前患者各项检测指标未见有统计学差异。与对照组治疗后相比较,试验组治疗后患者LSM、CAP、ALT、AST、GGT、GLU、Ins、HOMA-IR、CHOL、LDL-C有统计学意义的降低。其它检测指标未见有统计学差异。结论:基础治疗12周可明显降低非酒精性脂肪肝患者体重、BMI、LSM和CAP达到主要治疗效果,但是对肝脏功能、血脂调节和胰岛素抵抗未见明显改善。脂必泰干预加上基础治疗12周可明显降低非酒精性脂肪肝患者体重、BMI、LSM和CAP达到主要治疗效果,同时可明显改善患者肝脏功能、降低血脂和改善胰岛素抵抗。试验组对非酒精性脂肪肝患者的治疗作用优于对照组。且脂必泰对肝功能、血脂和胰岛素抵抗有改善作用。脂必泰治疗非酒精性脂肪肝患者达到主要治疗终点和次要治疗终点。
张璎[4]（2020）在《HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义》文中认为目的探讨血清原卟啉（PPⅨ）检测在乙型肝炎病毒（HBV）相关慢性肝病患者肝功能损害中的临床意义,明确血清PPⅨ能否作为慢性肝病患者肝功能损害的早期预警及病情评估的敏感参数。方法纳入2018年10月至2019年10月就诊于西安医学院第一附属医院诊断为HBV相关慢性肝病患者110例作为病例组,其中慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者50例,肝硬化（HC）患者40例,肝癌（HCC）患者20例,于同期在本院体检科征募健康人群40例作为对照组。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）,检测所有研究对象的血清PPⅨ,常规方法检测肝功、凝血等实验室指标,比较肝病患者与健康人群的血清PPⅨ;评价PPⅨ对HBV相关慢性肝病的诊断效能;分析PPⅨ与各实验室指标的相关性。结果1.（1）肝病组与对照组血清PPⅨ比较:CHB、HC、HCC三个肝病组血清PPⅨ显着高于对照组,44.29（25.99,85.36）、72.73（48.28,90.43）、91.79（68.34,121.52）vs15.43（10.87,20.16）ng/dl,差异均有统计学意义（P<0.05）;HC组虽较CHB组PPⅨ升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;HCC组较CHB、HC组PPⅨ显着升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）CHB与HC患者组内血清PPⅨ比较:CHB患者进一步分为静止期与活动期,肝硬化患者分为代偿期与失代偿期。与代偿期HC患者相比,失代偿期HC患者血清PPⅨ显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而CHB患者活动期与静止期PPIX比较,差异无统计学意义（P>0.05）。HC患者代偿期与CHB患者静止期、HC患者失代偿期与CHB患者活动期PPⅨ比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;HC患者失代偿期较CHB患者静止期血清PPⅨ显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.ROC曲线显示,PPⅨ诊断CHB的曲线下面积（AUC）为0.873,利用约登指数确定临界值为20.325 ng/dl,其敏感度为86%,特异度为77.5%;诊断HC的AUC为0.748,临界值为33.695 ng/dl,其敏感度为90%,特异度为61.1%;诊断HCC的AUC为0.812,临界值为65.26 ng/dl,其敏感度为85%,特异度为69.2%。3.（1）不同肝病组间实验室指标比较:HCC组AFP显着高于CHB和HC组,差异有统计学意义（P<0.05）,其余实验室指标与HC组相比,差异均无统计学意义（P>0.05）;与CHB组相比,HC组和HCC组TBIL、GGT、PT显着升高,PLT、CHE、ALB、PT%显着降低,差异均有统计学意义（P<0.05）;而HBV-DNA、ALT、ALP在三组间差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）CHB静止期和健康对照组的PPⅨ及肝功指标比较:CHB患者静止期PPⅨ显着高于健康对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,而肝功指标与健康对照组相比,仅CHE稍升高,其余差异均无统计学意义（P>0.05）。4.PPⅨ与各指标的相关性:CHB患者PPⅨ与各指标均不存在显着相关性（P>0.05）;HC患者PPⅨ与年龄、AFP、TBIL、AST呈正相关（P<0.05）,与PLT、CHE、ALB呈负相关（P<0.05）,仅与TBIL呈中等正相关（rs=0.587,P<0.05）,与ALB呈中等负相关（rs=-0.408,P<0.05）,其余均为弱相关（rs<0.4,P<0.05）;HCC患者PPⅨ与TBIL呈中等正相关（rs=0.470,P<0.05）,与CHE呈中等负相关（rs=-0.459,P<0.05）。结论1.HBV相关慢性肝病患者血清PPⅨ显着高于健康对照组,且与慢性肝病进展呈活动依赖性。2.血清PPⅨ可作为HBV相关慢性肝病患者肝损害的早期预警及病情评估的敏感参数。
许杰[5]（2020）在《基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制》文中提出目的:1.从中医学“痰瘀”的角度,评估抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效及相关数据,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供最新的循证医学证据。2.基于网络药理学运用网络数据挖掘技术筛选抗纤软肝颗粒治疗肝纤维化活性成分,并对成分作用潜在靶点与机制进行整合与分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的药理学机制,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供科学依据,以及为后续实验研究提供一定基础。3.通过细胞实验与动物实验,基于肝窦毛细血管化,探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:1.采用临床回顾性对照研究的方法,从“痰瘀”的角度,研究抗纤软肝颗粒对痰瘀互结型肝纤维化患者临床疗效。将60例慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化患者,分为2组:治疗组患者利用抗纤软肝颗粒联合恩替卡韦（entecavir,ETV）治疗,对照组仅予ETV抗病毒治疗。治疗6个月,比较治疗前后中医证候积分、血清部分肝功能指标、血清肝纤维化及肝脏弹性等指标变化情况。2.采用网络药理学的研究方法,借助Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM）结合DisGeNET,Genecard,HPO,OMIM疾病靶点数据库,通过构建抗纤软肝颗粒活性成分作用靶点网络与肝纤维化疾病相关靶点网络相互映射来挖掘抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用靶点,利用STRING进行生物过程和通路富集分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的通路研究。3.分别采用细胞实验与动物实验的方法:（1）细胞实验中,采取二次重复给药的方式,通过Wistar雄性大鼠制备和提取抗纤软肝颗粒和对照组含药血清,分别处理原代肝窦内皮细胞模型。采用Western-blotting方法检测肝窦内皮标志物分化抗原簇31（CD31）和血管性血友病因子（vWF）的蛋白表达水平,分析抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞分子水平的影响;采用免疫组织化学的方法检测细胞中CD31、vWF细胞因子表达水平;通过扫描电镜检测肝窦内皮细胞窗孔的变化。（2）动物实验中,通过CCl4--橄榄油混合溶液皮下注射与低蛋白高脂饲料喂养Wistar雄性大鼠诱导肝纤维化动物模型,运用拆方研究的方法,以索拉非尼作为对照药物,研究抗纤软肝颗粒（母方,MF）、母方去鳖甲方（QJ）和鳖甲（BJ）对肝纤维化大鼠一般情况、血清肝功能、肝组织和血清MMP13和TIMP-1分子、肝组织病理学、肝组织肝窦毛细血管化、肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响。另外,对肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子进行测量,观察抗纤软肝颗粒组及其拆方各组对肝组织细胞膜脂质过氧化和酶促防御系统的影响的影响,进而观察其对肝窦毛细血管化的影响。采用生化检测大鼠血清部分肝脏功能ALT、AST、ALB、IgG水平;采用qRT-PCR方法检测大鼠肝组织中MMP-13、TIMP-1和VEGF的mRNA表达水平;采用Western-blotting方法检测肝组织中CD31、vWF、CollagenⅠ和CollagenⅣ的蛋白表达水平;分别采用H&E染色和天狼星红染色检测肝大鼠肝组织病理变化;通过扫描电镜检测大鼠肝组织肝窦内皮细胞窗孔及基底膜的变化;用ELISA法检测大鼠血清中MMP-13、TIMP-1的表达水平;采用生化检测方法检测大鼠肝组织NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP指标。结果:1.临床研究结果:抗纤软肝颗粒对慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化痰瘀互结型患者临床研究共收集病例60例,其中男29例,女31例,年龄18-65岁,平均52.5岁,治疗组32例,对照组28例。（1）两组病例在性别、年龄、肝纤维化程度、治疗前主要症状和舌脉积分分布等方面行x2检验,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者临床症状总疗效的影响,结果显示:与对照组相比,治疗组总有效率（84.375%vs60.7 1%）、显效率（53.125%vs28.57%）,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者症候积分的影响及单项症状总有效率比较,结果显示:治疗前两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（23.40±4.14vs22.80±3.85,t=0.5786,P>0.05）;治疗后两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（8.75±3.28vs15.84±4.24,t=7.2916,P<0.01）。两组治疗前后组内比较,治疗后治疗组与对照组中医证候积分均较治疗前下降,差异有显着统计学意义（t=15.6901,P<0.01）。两组对肝纤维化单项症状积分总有效率影响,与对照组比较,治疗组各项单项症状总有效率均显着增高,差异有显着统计学意义（t=11.406,P<0.01）。与对照组相比,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组能显着减轻患者临床症候:右胁隐痛、腹胀、乏力、纳差、便溏、舌暗红/淡暗、苔白腻、脉滑涩等。（4）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者部分肝功能指标的影响,结果显示:对照组与治疗组在治疗前后进行组内比较,两组ALT、AST、TBIL、GGT各项指标治疗后均较治疗前下降明显,差异有显着统计学意义（P<0.01）。另外,治疗后两组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（5）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝纤维化指标的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,两组HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN指标治疗后均较治疗前下降,差异有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后两组组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义（P<0.01）。（6）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝脏弹性的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,可见对照组治疗前后指标比较差异无统计学意义（P>0.05）,而治疗组在治疗前后比较,肝脏硬度指标明显下降,差异有显着统计学意义（P<0.01）。另外,两组治疗后组间比较,治疗组较对照组明显降低肝脏硬度指标,差异有显着统计学意义（P<0.01）。2.网络药理学分析结果:在Batman-TCM中输入抗纤软肝颗粒的7种药物,分别搜索到鳖甲1个,丹参39个,地骷髅2个,莪术6个,海藻1个,牡蛎5个,生山楂30个化合物信息,共计84个。通过DisGeNET,Genecard,OMIM,HPO检索并筛选821个肝纤维化疾病相关的靶点,整合筛选出抗纤软肝颗粒成分和肝纤维化交集关键靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络,以大于平均自由度为筛选条件筛选出核心网络,获得95个抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的相关靶点。通过STRING的GO功能和途径/通路富集分析得到2203条生物过程,181个分子功能和包括MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT、Toll受体等在内的162条KEGG通路,这些通路为抗纤软肝颗粒在临床中的使用提供更为有力的、可靠的药理学证据。3.实验研究结果:实验一:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞中形态的影响:肝窦内皮细胞经经免疫荧光单标、荧光显微镜观察鉴定。倒置相差显微镜下观察,与对照血清组（Control组）比较,抗纤软肝颗粒含药血清组（MF组）肝窦内皮细胞形态学无明显变化。（2）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞窗孔结构的影响:对照组肝窦内皮细胞窗孔狭小,窗孔结构将近闭塞,数量较少,而抗纤软肝方组可见肝窦内皮细胞窗孔结构清晰,窗孔增多增大,明显可见。（3）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31和vWF细胞因子的影响:抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF细胞因子的表达水平较对照组明显降低,差异有显着统计学意义（CD31:0.0688±0.0150vs0.1151±0.0114,t=4.2565,P<0.05;vWF:0.0920±0.0089vs0.1319±0.0135,t=4.2740,P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31、vWF蛋白表达的影响:与对照组相比,抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF的蛋白表达水平明显降低,差异有显着统计学意义（CD31:0.3337±0.0290vs0.4480±0.0128,t=6.2454,P<0.01;vWF:0.5603±0.0472vs0.7093±0.0448,t=3.9658,P<0.05）。实验二:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对大鼠一般情况的影响:造模组体重增长受到抑制,其它治疗组大鼠体重均有增加。与模型组比较,抗纤软肝颗粒母方组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。母方组肝纤维化死亡率和腹水发生率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。肝脏指数和脾脏指数各组比较无明显统计学差异（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对大鼠肝功能的影响:经抗纤软肝颗粒组及其拆方各组治疗后血清ALT、AST、IgG水平显着下降,而血清ALB的水平显着上升,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织及血清MMP13、TIMP-1分子的影响:分别用qRT-PCR和ELISA法测定后显示,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可降低肝组织TIMP-1的mRNA表达水平和血清TIMP-1分子水平,而升高肝组织MMP13的mRNA表达水平和血清MMP13的分子水平,差异有显着统计学意义（P<0.01）。与Sor组比较,母方组可明显调节肝组织和血清MMP13、TIMP-1的表达水平,差异有显着统计学意义（P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织病理学的影响:H&E染色中,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可明显改善大鼠肝组织病理变化、肝细胞变性坏死程度、抑制肝组织内结缔组织增生,尤其是母方组。与Sor组相比,母方组（MF组）肝纤维化改善程度更为明显。在天狼星红染色中,与模型组比较,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组纤维组织成分含量明显减少,母方组纤维组织含量降低最为明显。（5）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化的影响:与模型组相比,抗纤软肝颗粒及其拆方各组肝组织,尤其是抗纤软肝颗粒组可见肝细胞索和肝窦结构较清晰,肝窦沟可显现,肝窦扭曲、狭窄程度明显减轻,甚至消失,基底膜较薄或不连续,有的肝窦结构接近正常,肝窦壁内皮细胞窗孔明显可见,与Sor组相比,母方组大鼠肝组织可见肝窦扭曲、狭窄程度改善最为显着。（6）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低VEGF的mRNA表达水平,与Sor组比较,抗纤软肝颗粒组差异有统计学意义。抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平,尤其是抗纤软肝颗粒组。与Sor组比较,抗纤软肝颗粒对于降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平效果更为显着,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低MDA、NO、NOS和HYP表达水平,而升高T-SOD表达水平,差异具有统计学意义。与Sor组比较,母方组可明显调节MDA、T-SOD、NO、NOS和HYP的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.对于治疗CHB肝纤维化痰瘀互结证,抗纤软肝颗粒联合ETV与单用ETV治疗比较,两组均显示一定疗效,均可改善患者临床证候、肝功能和肝纤维化指标。对单用ETV对照组比较,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组对于改善肝纤维化患者临床证候,部分肝功能和肝纤维化指标有明显优势,尤其在改善肝脏硬度方面。抗纤软肝颗粒在肝纤维化“痰瘀互结”证的治疗中起到明显软坚消痰、活血化瘀的抗肝纤维化作用。2.通过网络药理学预测分析发现抗纤软肝颗粒作用肝纤维化的相关机制可能跟MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、Toll样受体等信号通路密切相关,抗纤软肝颗粒具有抗肝纤维化的药理学依据。3.细胞实验与动物实验研究结果表明,抗纤软肝颗粒对体外原代肝窦内皮细胞和体内大鼠肝纤维化组织肝窦毛细血管化有积极的治疗作用。同时,动物实验中发现,中药复方抗纤软肝颗粒、去鳖甲方与鳖甲均具有明显的抗肝纤维化作用,尤其是母方（抗纤软肝颗粒）疗效最佳。抗纤软肝颗粒对肝纤维化的作用机制,可能是通过抑制肝窦毛细血管化而防治肝纤维化。
常晓燕[6]（2020）在《泽泻汤化学成分及抗非酒精性脂肪肝谱效关系研究》文中研究表明泽泻汤为古代经典名方,出自东汉张仲景《金匮要略》,由泽泻与白术以5:2比例配伍组成,现代临床及实验研究表明泽泻汤具有治疗高脂血症的药理作用。在此研究基础上,为进一步揭示泽泻汤化学成分,探究泽泻汤是否具有预防与治疗非酒精性脂肪肝的作用,并探讨发挥作用的关键药效物质,本论文采用UPLC-MS/MS高分辨质谱技术鉴定泽泻汤主要化学成分及入血成分,并对泽泻汤水及乙醇提取物化学成分进行比较;采用油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积模型,评价泽泻汤水提取物及乙醇提取物体外抗非酒精性脂肪肝的作用,利用RT-qPCR技术探究泽泻汤抗非酒精性脂肪肝作用机制;建立泽泻和白术不同配伍比例的泽泻汤提取物的化学指纹色谱,结合其对HepG2细胞脂肪累积的抑制作用,进行谱效研究,筛选泽泻汤抗非酒精性脂肪肝药效成分;采用分子对接技术验证筛选出的潜在药效成分与非酒精性脂肪肝相关蛋白的结合能力,初步阐明药效成分作用的分子机制。具体研究内容如下:1.基于LC-MS的泽泻汤主要化学成分及入血成分研究采用UPLC-Q-TOF高分辨质谱技术,鉴定泽泻汤水及乙醇提取物主要化学成分,通过优化液相条件,实现泽泻汤两种提取物化学成分同时进行分离和分析。采用正离子模式进行检测,通过与对照品及相关文献进行对比,根据色谱峰保留时间、精确分子质量和多级质谱碎片信息,从泽泻汤中共鉴定出24个色谱峰,主要为三萜类和倍半萜类化学成分,并发现泽泻汤水提物与乙醇提取物中三萜类化学成分的种类和含量存在较大差异。泽泻汤提取物口服灌胃大鼠后,收集大鼠血清,采用UPLC-Q-Exactive轨道阱高分辨质谱技术分析泽泻汤入血成分,共发现4个泽泻汤入血原形成分。上述实验结果为泽泻汤进一步的化学及药效研究提供了基础。2.泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用研究采用油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积模型,评价泽泻汤水及乙醇提取物抗非酒精性脂肪肝的能力。泽泻汤水及乙醇提取物在给药浓度为80与160 mg/mL时能极显着降低HepG2细胞脂肪累积量（P<0.01）,40 mg/mL浓度能显着降低HepG2细胞脂肪累积量（P<0.05）,两提取物均表现出较好的剂量依赖性,且乙醇提取物表现出更强的抑制作用,表明泽泻汤具有潜在治疗非酒精性脂肪肝的作用。利用RT-qPCR技术分析了泽泻汤提取物对脂肪酸代谢、胆固醇代谢及炎症反应相关基因的调控,发现泽泻汤可能通过影响PPARα、HMG CR、ACC、FAS及NF-κB等基因的表达来减少胆固醇和脂肪酸的合成,加快脂质的分解和运输,减轻肝脏炎症反应来产生治疗非酒精性脂肪肝的作用。3.泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用谱效关系研究采用UPLC-Q-TOF高分辨质质谱技术,建立泽泻和白术不同配伍比例泽泻汤提物指纹图谱,并考察其对HepG2细胞脂肪累积的抑制作用,对泽泻汤抗非酒精性脂肪肝作用进行谱效关系研究。利用中药指纹图谱相似度评价软件对色谱图进行匹配并给出共有峰及峰面积,建立以峰面积为自变量,HepG2细胞脂肪累积抑制能力为因变量的数据集,采用聚类分析、相关分析、灰色度关联分析及偏最小二乘回归分析进行谱效分析,考察各色谱峰与药效的相关性,最终发现alisol B 23-acetate、alisol B、16-oxo-11-anhydro-alisol A、alisol L、alisol C 23-acetate、atractylenolide Ⅰ 和tetradecylcitric acid 7个化学成分与药效相关性较强。4.基于分子对接技术的泽泻汤药效成分验证利用MOE软件对筛选出的三萜类药效成分与FXR蛋白进行模拟对接,发现筛选出的5个潜在药效成分均可通过空间互补、氢键及范德华力与FXR蛋白发生结合,且相对活性为 alisol B 23-acetate>alisol C23-acetate>alisol L>16-oxo-11-anhydro-Alisol A>alosol B,其中 alisol B 23-acetate 与 alisol C 23-acetate 及 alisol L 的最佳构象对接自由能数值较为接近,对接活性相似,1 6-oxo-11-anhydro-AlisolA与alosolB的对接能力低于其他三个化合物,5个化合物均可与FXR发生结合,可能作为FXR激动剂发挥其抗非酒精性脂肪肝作用。综上所述,本文从谱效相关性角度对泽泻汤主要化学成分及体外抗非酒精性脂肪肝潜在药效成分进行研究,不仅为泽泻汤进一步化学及药效研究提供了基础,也为寻找非酒精性脂肪肝治疗药物提供了重要依据。
马宁[7]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中研究指明第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
李朋[8]（2020）在《非生物型人工肝联合肝移植治疗乙肝慢加急性肝衰竭患者的临床疗效及短期预后转归》文中研究表明背景与目的乙肝相关的慢加急性肝衰竭（Hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF）是乙肝发展的严重阶段,病情进展快且危重,如不及时规范治疗,病死率高达50%以上。肝移植作为治疗肝衰竭的有效方法,在一些大型移植中心效果显着,肝移植后1年生存率可达到80-90%以上,但其局限性在于供肝缺乏。人工肝支持系统治疗可显着改善肝衰竭患者的肝肾功能以及凝血功能等,使患者的MELD评分显着降低,并降低患者病死率,同时可有效延长患者等待供肝的时间,但术前行人工肝治疗是否对患者移植后的生存率有影响,目前相关数据仍较少。本研究旨在探究肝移植前行非生物型人工肝治疗对肝移植患者的手术及预后的影响,探究预后影响因素,并评估目前常用的ACLF预后模型对于肝移植后短期预后的预测能力。研究方法回顾性选取2011年1月至2018年12月浙江大学医学院附属第一医院收治的166例因HBV-ACLF而行肝移植（Liver transplantation,LT）治疗的住院患者作为研究对象,其中109例患者在肝移植前一共进行了322次以选择性血浆置换（plasma exchange,PE）为中心,根据病情联合血液透析滤过、胆红素吸附等人工肝模式治疗后行肝移植手术,并纳入ALSS+SMT+LT组（观察组）,其余57例患者给与单纯内科治疗（Standard medical therapy,SMT）后行急诊肝移植手术治疗,并纳入SMT+LT组（对照组）。记录所有研究患者的一般资料,治疗前后的临床指标、实验室指标、预后等变化,并在肝移植后随访4周、12周、48周、96周。计量资料采用均数±标准差（`x±S）或中位数（四分位数值）表示,符合正态分布的数值采用student-t检验,非正态分布的数据采用wilcoxon秩和检验,计数资料描述为百分率（%）,采用卡方检验和Fisher检验;将影响预后的因素纳入单因素及多因素COX风险比例模型分析,对两组患者的生存率使用Kaplan-meier曲线进行生存分析。所有数据均使用SPSS 23.0软件包及R语言软件进行统计学分析,检验结果P值<0.05被认为有统计学差异。研究结果1. 患者入组时基线值观察组患者较对照组相比,其年龄轻,ALT/AST、TBil、TBA、PLT更高（P均<0.05）,性别、血压及其余各项实验室指标（WBC、N%、Alb、INR、PTA、Cr、Na+、HBV-DNA、NLR）、并发症以及MELD、CLIF-C-ACLF、CLIF-C OFs、COSSH-ACLF、NLR评分均无统计学差异（P>0.05）。2. ALSS的疗效ALSS治疗后患者肝肾功能、凝血功能、电解质指标均较首次ALSS治疗前明显好转。ALT、AST、TBil、TBA、INR与首次治疗前相比显着降低,PTA、Na+较前显着升高（p均<0.05）,血常规中WBC、N%较前显着升高,HGB、PLT较前显着降低,p均<0.05;治疗后MELD评分、COSSH-ACLF评分较治疗前显着下降（P<0.001）,CLIF-C-ACLF评分有同样降低的趋势,但无统计学差异（P>0.05）。3. 两组相比,术前、术中及术后相关指标差异5.23±5.73天,P<0.05);术中失血量（1306.42±969.56ml vs 1843.86±1311.08ml）、术后ICU停留时间（9.79±5.68天vs 10.73±4.62天）均显着减少（P均<0.05）;术后总住院时间两组之间相比无显着性差异（28.22±12.52天vs 27.61±7.39天,P>0.05）。4. 两组患者生存分析166例患者的4W、12W、48W、96W生存率分别为88.0%,82.5%,77.1%,76.5%,其中观察组患者术后4W及12W生存率明显高于对照组,差异具有统计学意义（91.7%vs 80.7%,87.2%vs 73.7%,p均<0.05）;观察组术后48W及96W生存率同样高于对照组,但差异无显着性（80.7%vs 72.0%,79.8%vs 70.2%,p均>0.05）。对与166例患者预后相关的危险因素进行COX回归分析后得出:术前行人工肝治疗、术前NLR值、术中出血量是影响HBV-ACLF患者移植术后4w生存的独立影响因素。5. 各评分系统对患者移植术后短期预后（4W生存）的预测价值NLR曲线下面积（AUROC:0.882）明显高于COSSH-ACLF（AUROC:0.71,P=0.003）、MELD（AUROC:0.64）、CLIF-C ACLF（AUROC:0.70）、CLIF-C OFs（AUROC:0.65）。基线NLR值预测4W死亡率的最佳界值（cut-off值）为8.5,敏感性72.4%,特异性93.4%;COSSH-ACLF为6.79,敏感度84.2%,特异性60%;MELD为24.21,敏感度74%,特异性51%;CLIF-C ACLF为45.87,敏感度63.2%,特异度73%;CLIF-C OFs为9.5,敏感度84.2%,特异度46%。根据cut-off值结果,将患者进一步分组并进行生存分析,发现术前评分NLR≥8.5、COSSH-ACLF≥6.79、MELD≥28、CLIF-C ACLF≥45.87、CLIF-C OFs≥10.0时,术后短期死亡率显着增高。6.109例患者行ALSS治疗中出现的不良反应109例患者共进行了322次ALSS治疗,其中25例患者在治疗过程中出现了不同程度的不良反应,发生率为22.9%。其中深静脉血栓最常见,占44%（11/25）,其余不良反应包括皮肤瘙痒及皮疹20%（5/25）、恶心呕吐16%（4/25）、口周麻木12%（3/25）、低血压8%（2/25）、穿刺处出血8%（2/25）、继发感染4%（1/25）、心律失常4%（1/25）,出现两个及以上不良反应的患者占16%（4/25）。不良反应对于短期生存率无影响（p>0.05）。研究结论1.当HBV-ACLF患者无法及时获得供肝时,肝移植前行ALSS治疗可有效延长其等待供肝时间,争取肝移植机会,有效改善生化指标,降低MELD、COSSH-ACLF、CLIF-C-ACLF等评分,改善患者术前病情,提高手术耐受能力,减少患者肝移植术中出血量及术后ICU停留时间,改善移植术后的短期预后;2.术前ALSS治疗是影响HBV-ACLF患者肝移植后短期生存的独立保护因素,术前NLR值及术中出血量的增加是影响HBV-ACLF患者肝移植后短期生存的独立危险因素;3.HBV-ACLF患者肝移植前NLR值、COSSH-ACLF、MELD、CLIF-C-ACLF、亡率明显增高。
姜小艳[9]（2019）在《中医药治疗PBC的系统评价及通胆汤干预TAM分子家族治疗PBC的作用机制》文中研究指明研究目的:本研究拟通过循证医学方法,系统评价中药治疗PBC的临床随机对照实验的相关数据及方法学质量,为中药防治PBC提供循证医学证据。并通过观察通胆汤对PBC患者及模型小鼠肝脏酶学指标、TAM分子家族等方面的影响,进一步论证并探讨通胆汤的疗效及对TAM分子家族水平的影响。研究方法:1、系统评价采用检索式:英文检索词为（“Primary Biliary Cirrhosis”OR“Primary Biliary Cholangitis" OR“PBC”AND“Chinese Medicine”OR“Herb Medicine”AND“Randomized Controlled Trial（RCT））”;中文检索词为（中药、中医、辨证、中医药、剂、方、汤）AND（原发性胆汁性肝硬化OR原发性胆汁性胆管炎ORPBC）AND（随机）检索PubMed数据库,Cochrane图书馆,Embase,中国知网（China National Knowledge Internet,CNKI）、维普期刊资源整合服务平台（VIP）、万方数据（Wan Fang）、中国生物医学数据库（Chinese Biomedical Database,CBM）。收集中药治疗PBC的临床随机对照实验文献,严格遵循循证医学方法对文献进行质量评价及数据提取。数据均采用Review Manager5.3进行分析。对发表偏倚情况进行漏斗图分析。2、临床研究收集2016年1月～2019年1月在我院肝病科与消化科门诊及住院部就诊的PBC患者,根据纳入标准及排除标准最终纳入100例患者,采用SPSS单纯抽样随机入组80例患者,并随机分为对照组及治疗组。收集患者入组时的年龄、性别、合并的自身免疫性疾病等一般信息,检测肝脏酶学指标（ALP、GGT、AST、ALT、TB）,Firbscan值、TAM家族分子（Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6、Protein S）。并采集患者舌象、脉象,收集症状体征,对患者进行辨证分型。对照组患者单纯予UDCA治疗,治疗组患者予UDCA+通胆汤（根据证型加减）治疗,两组患者均治疗48周。采用Student’s t 检验、Fisher χ2（确切概率法）对患者一般资料,治疗前后组内组间疗效进行比较,Kaplan-Meier比较两组患者应答累积发生率,COX回归模型分析患者早期应答发生的相关因素,采用Pearson相关性分析、ROC曲线、COX回归模型探讨TAM分子家族与PBC主要酶学指标及早期应答之间的联系。3、动物实验研究将36只C57BL/6小鼠分为4组,A:对照组,6只C57BL/6小鼠,不予造模,仅予等量蒸馏水灌胃;B:模型组,10只造模的PBC模型C57BL/6小鼠,予等量蒸馏水灌胃;C组:阳性组,10只造模的PBC模型C57BL/6小鼠,予熊去氧胆酸胶囊0.1g/（kg·d）灌胃;D组:中药组,10只造模的PBC模型C57BL/6小鼠,予熊去氧胆酸胶囊O.1g/（kg.d）灌胃,并予浓度为2.1g/ml的通胆汤以1ml/100g·d剂量灌胃。造模小鼠采用polyI:C（聚肌胞苷酸）5mg/kg剂量腹腔注射构建实验动物模型。小鼠干预方案于造模第12周进行,共干预12周。干预结束后,收集小鼠的肝脏酶学指标（ALP、GGT、AST、ALT、TB）,外观形态及体重,肝脏形态、肝脏指数、肝脏病理标本（HE染色及Sirus red染色）、TAM受体家族分子蛋白（Axl、Mer、Tyro3、Gas6、Protein-S）指标（qPCR及Western Blot）。计数资料采用Kruskal-Wallisχ2行总体检验,再行Mann-Whitney U两两比较。计量资料采用ANOVO检验,LSD/Dunnett T3进行两两比较。研究结果:1、系统评价（1）系统评价共纳入15篇文章,15项研究的试验组及对照组患者的基线资料具有可比性（P>0.05）,样本量40-178个不等,15项研究的患者合计为1213例。15项研究的对照组干预措施为口服熊去氧胆酸加用基础护肝方案,试验组均为在对照组治疗方案基础上加用口服复方中药或者中成药。（2）15项研究中,8项研究阐述了随机分配方法,7项研究属于随机但未描述随机分配方法;15项研究的分配隐藏方法及盲法均不清楚;14项研究的结局报告完整,1项研究的结局报告不完整;15项研究的计划报告书不可获得。（3）临床应答率方面,15项研究中11项研究观察了患者临床应答率,相比于单纯西医治疗,提示中西医结合治疗（试验组）能有效提高患者临床应答率（Z=6.19,P<0.00001）,OR=0.27（0.18,0.41）。漏斗图提示对称性不佳,提示存在发表偏倚。（4）15项研究中,10项研究观察了 ALT、AST、TB、ALP水平变化,结果显示中西医结合治疗（试验组）疗效更显着,能更好的改善ALT（（Z=15.21,P<0.00001）,MD=-13.82（-15.60,-12.04））、AST 水平（Z=11.74,P<0.00001）,MD=-12.33（-14.39,-10.27）)、TB 水平（（Z=16.17,P<0.00001）,MD=-10.06（-11.27,-8.84））、ALP 水平（（Z=6.55,P<0.00001）,MD=-49.42（-64.21,-34.62））。漏斗图分析均提示研究存在发表偏倚风险。（5）11项研究观察了 GGT水平,结果显示中西医结合治疗（试验组）疗效更显着,能更好的改善 GGT 水平（（Z=5.02,P<0.00001）,MD=-28.15（-39.15,-17.15））。漏斗图分析提示研究存在发表偏倚风险。（6）6项研究观察了 IgM水平,结果显示中西医结合治疗（试验组）疗效更显着,能更好的改善 IgM 水平（（Z=7.77,P<0.00001）,MD=-0.98（-1.23,-0.73））。漏斗图分析提示研究存在发表偏倚风险。（7）5项研究观察了 IgG水平,结果显示中西医结合治疗（试验组）疗效更显着,能更好的改善IgG 水平（（Z=4.86,P<0.00001）,MD=-2.46（-3.45,-1.47））。漏斗图分析提示研究存在发表偏倚风险。（8）4项研究观察了 IgA水平,结果显示中西医结合治疗（试验组）疗效更显着,能更好的改善 IgA 水平（（Z=3.21,P=0.001）,MD=-0.52（-0.84,-0.20））。漏斗图分析提示研究存在发表偏倚风险。（9）根据治疗疗程对GGT行亚组分析。疗程为6周的亚组纳入2项研究,两组疗效未见明显差异（（Z=1.40,P=0.16）,MD=-29.20（-70.18,11.77））。疗程为 18 周的亚组纳入一篇文献,行描述性分析,疗程24周、48周的亚组各纳入6项、3项研究,结果均显示治疗组疗效更明显（（Z=3.68,P=0.0002）,MD=-42.72（-65.49,-19.95）;（Z=8.36,P<0.00001）,MD=-13.72（-16.93,-10.05））。（10）根据治疗疗程对ALP行亚组分析。疗程为6周、24周、48周的亚组各纳入2项、7项、3项研究,疗程为6周的亚组两组结果未见明显差异（（Z=1.42,P=0.16）,MD-52.54（-125.19,20.11））,疗程为24周、48周的亚组结果均显示治疗组疗效更明显（（Z=8.81,P<0.00001）,MD=-53.13（-64.95,-41.32）;（Z=6.22,P<0.00001）,MD=-29.31（-38.54,-20.07））。（11）15项研究提及不良反应与事件的研究较少,因临床异质性较大、数据不充分故未做meta分析。根据研究记录,不良反应发生事件主要为恶心呕吐、腹痛、腹泻、荨麻疹、总胆汁酸升高、心悸等。敏感性分析提示meta分析结果较稳定,结果较可靠。（12）敏感性分析提示meta分析结果较稳定,结果较可靠。2、临床研究（1）两组患者的基线年龄、性别比例,合并其他自身免疫性疾病的比例,AMA-M2、AMA-M4、AMA-M9、ANA抗体阳性比及中医证型比例均未见明显统计学差异（P>0.05）。两组患者基线肝脏酶学指标ALP、GGT、ALT、AST、TB及TAM分子家族（Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6、Protein S）、Firbscan 均未见明显统计学差异（P>0.05）。（2）两组患者治疗后ALP、GGT、ALT、AST、TB水平及Firbscan值均较治疗前显着性降低（P<0.05）。治疗组患者治疗前后ALP水平、Firbscan水平改善程度较对照组明显（P<0.05）。（3）对照组患者治疗后Axl、Mertk、Gas6、Protein S较治疗前改善明显（P<0.05）,治疗组患者治疗后Axl、Mertk、Gas6、Tyro-3、Protein S水平较治疗前改善明显（P<0.05）。治疗组患者治疗前后Axl、Mertk、Gas6、Protein S改善程度较对照组明显（P<0.05）。（4）治疗组患者的早期应答累积发生率较对照组患者高（P<0.05）,且治疗组患者的平均应答时间较对照组短（P<0.05）。（5）ALP 与 Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6 有显着相关性（r=0.366、0.919、0.939、0.432,P=0.001、0.000、0.000、0.000<0.01）;GGT 与 Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6 有显着相关性（r=0.260、0.835、0.776、0.350,P=0.025、0.000、0.000、0.002<0.05）;Firbscan值与 Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6 有显着相关性（r=0.267、0.805、0.838、0.310,P=0.017、0.000、0.000、0.007<0.05）。（6）ROC 曲线示 Gas6、Mertk、Tyro-3 对早期应答评估的 AUC Gas6=0.704（0.528-0.879）,AUCMertk=0.944（0.891-0.997）,AUCTyro-3=0.942（0.884-0.999）（P<0.05）。Gas6在20.15时敏感度为0.833,特异度0.629。Mertk在22.73时敏感度为1,特异度为0.758。Tyro-3在8.69时敏感度为1,特异度为0.790。（7）早期应答发生的单因素COX回归分析,显示组别（治疗组）与患者是否发生应答正相关（RR=38.885>1,P<0.05）。TB、ALT、AST与患者发生应答负相关（RR=0.095、0.014、0.985<1,P<0.05）。Axl、Mertk、Tyro-3 与患者发生应答负相关（RR=0.479、0.403、0.244<1,P<0.05）。Protein S与患者是否发生应答正相关（RR=1.068>1,P<0.05）。多因素COX回归分析示组别（治疗组）与患者是否发生应答正相关（RR=5.265>1,P=0.000<0.05）。（8）所有患者未发现与治疗有直接关系的不良反应。3、动物实验研究（1）干预结束后,对照组与模型组小鼠在形体外观上未见明显差异。在肝脏外观形态上,对照组与模型组小鼠肝脏轮廓清晰,结构正常,表面尚光滑,外观颜色未见明显差异。模型组小鼠肝脏稍偏大,质地稍韧。两组小鼠24周时体重未见显着性差异（P>0.05）,模型组小鼠肝脏指数较对照组小鼠显着性升高（P<0.05）。（2）与对照组比较,模型组小鼠AMA-M2阳性率显着性升高（P<0.05）;与模型组比较,阳性组及中药组小鼠AMA-M2阳性率无显着性差异（P>0.05）;与阳性组比较,中药组小鼠AMA-M2阳性率无显着性差异（P>0.05）。（3）与对照组小鼠比较,模型组小鼠ALP、GGT、ALT、AST、TB水平均比对照组小鼠显着性升高（P<0.05）。与模型组相比,阳性组及中药组小鼠ALP、GGT、ALT、AST、TB水平均显着性降低（P<0.05）。与阳性组小鼠相比,中药组小鼠ALP、TB水平均显着性降低（P<0.05）。（4）对照组小鼠肝脏病理图片大致正常。模型组小鼠肝脏病理图片见胆管损伤,汇管区肉芽肿结构等改变。阳性组小鼠肝脏病理图片示胆管炎症,损伤程度较模型组小鼠减轻。中药组小鼠肝脏病理图片示胆管周围少量炎细胞浸润,汇管区略扩张。（5）Western Blot结果显示,与对照组小鼠相比,模型组小鼠Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6蛋白表达显着性升高,Protein S蛋白表达显着性降低（P<0.05）。与模型组小鼠相比,阳性组小鼠Axl、Mertk、Tyro-3蛋白表达显着性降低,中药组小鼠Axl、Mertk、Gas6蛋白表达显着性降低,中药组小鼠Protein S蛋白表达显着性升高（P<0.05）。与阳性组小鼠比较,中药组小鼠Axl、Gas6蛋白表达显着性降低,Protein S蛋白表达显着性升高（P<0.05）。（6）qPCR结果显示,与对照组小鼠相比,模型组小鼠Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6蛋白表达显着性升高,Protein S蛋白表达显着性降低（P<0.05）。与模型组小鼠相比,阳性组小鼠Axl、Mertk、Tyro-3蛋白表达显着性降低,中药组小鼠Axl、Mertk、Gas6蛋白表达显着性降低,中药组小鼠Protein S蛋白表达显着性升高（P<0.05）。与阳性组小鼠比较,中药组小鼠Axl蛋白表达显着性降低,Protein S蛋白表达显着性升高（P<0.05）。结论:1、中医药治疗PBC的系统评价提示中药联合UDCA临床疗效更显着。但由于所入的研究质量欠高,较少提及并观察记录不良反应,故对该部分的结果应持谨慎态度。2、临床研究显示熊去氧胆酸联合中药治疗PBC患者,临床疗效更显着,能更好地改善患者的TAM家族分子水平。进一步分析发现TAM家族分子水平与PBC的主要酶学指标及早期应答存在密切联系。3、动物实验提示熊去氧胆酸联合通胆汤干预PBC小鼠,能更好的改善小鼠的肝脏病理,降低PBC小鼠的肝脏酶学指标及TAM分子家族Axl、Gas6水平。
徐莹[10]（2019）在《虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究》文中研究指明1.背景及目的:在我国,无论相对发病率还是绝对病例数,肝纤维化患者均居世界首位,其主要病因为:病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病或药物性肝病等,肝纤维化不仅是肝脏损伤的病理修复反应,还会进一步发展为肝硬化、肝癌、肝衰竭[1],是严重危害人民健康和消耗社会资源的难治性疾病。因此,抗肝纤维化是慢性肝病的重要治疗环节。西医学已有较多的临床试验报道,对于慢性病毒性（乙型、丙型）肝炎抗病毒治疗可有效逆转肝纤维化[2],但迄今临床上仍缺乏直接针对纤维结缔组织增生的有效治疗肝纤维化的生物或化学药物,而中药及其复方具有多组分、多途径与多环节的综合作用特点,近年来发现在抗肝纤维化治疗方面有明显优势,已经取得了较好的临床疗效,如扶正化瘀胶囊（片）、复方鳖甲软肝片等[3-5]。虫草菌丝作为中医药抗肝纤维化药物扶正化瘀胶囊/片中最重要的扶正药物,课题组前期大量研究证实以虫草菌丝为主药的扶正药物在促进肝纤维化逆转中发挥主要作用,为了解析其发挥抗肝纤维化作用的主要活性成分,课题组前期开展系列活性导向研究,并在近两年取得了可喜的进展,成功从虫草菌丝主要活性部位中分离并证实了一种脂溶性成分C02是虫草菌丝抗肝纤维化主要活性成分,课题组目前已经申请国家发明专利,但由于C02成分抗肝纤维化的作用机制仍不明确,制约了其进一步的新药开发与应用。因此本研究拟开展C02体内外抗肝纤维化研究,试图解析其抗肝纤维化机制,为其新药开发与应用提供参考。2.方法:（1）C02体内抗肝纤维化作用与机制研究:建立CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型,给予C02干预治疗后,收集血清及肝组织。通过肝组织HE及天狼猩红胶原染色、羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量、血清肝功能指标、纤维化相关指标因子的免疫组化及蛋白、基因水平变化等检测,探讨虫草菌丝活性成分C02潜在抗纤维化的作用机制。（2）C02对肝星状细胞（HSCs）与巨噬细胞活化、增殖的影响:体外采用不同浓度的C02对激活的JS-1（小鼠肝星状细胞）进行干预,观察HSCs活化、增殖相关基因及蛋白的变化;采用不同浓度的C02对LPS激活的巨噬细胞（RAW264.7小鼠巨噬细胞）进行干预,检测巨噬细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。（3）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:体外采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活化模型,给予C02及STAT1抑制剂干预24 h,去药后与正常JS-1细胞共培养24 h,分别收取RAW264.7巨噬细胞及JS-1细胞,检测巨噬细胞及肝星状细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。观察活化的巨噬细胞对肝星状细胞活化的影响以及C02的干预作用;3.结果:（1）C02对CCl4诱导肝纤维化小鼠的干预作用:C02对CCl4诱导的纤维化小鼠肝功能有明显的改善作用,C02中、高剂量组可有效降低血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;小鼠肝组织天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显着减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组,荧光定量RT-PCR和Western-blot结果表达与免疫组化结果基本一致（P<0.01或P<0.05）。Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显着下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组小鼠M1型巨噬细胞标记物CD11b阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD206阳性表达较模型组有所增加。（2）C02对DMN诱导肝纤维化大鼠的干预作用:C02对DMN诱导的纤维化大鼠肝功能有改善作用,C02中、高剂量组可有效降低AST、ALT含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;大鼠天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显着减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）,荧光定量PCR及Western-blot结果与免疫组化的结果表达基本一致。Western-blot结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显着下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组大鼠M1型巨噬细胞标记物CD68阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD163阳性表达较模型组有所增加。（3）C02对肝星状细胞（HSCs）及巨噬细胞活化、增殖的影响:C02能够呈剂量依赖性的抑制小鼠肝星状细胞（JS-1）及原代肝星状细胞的增殖（P<0.05）;JS-1细胞经5 ng/m L TGF-β1处理激活造模,采取不同浓度C02干预,较模型组相比,40μM C02可显着降低JS-1细胞α-SMA和COL-I基因及蛋白的水平（P<0.05）;F-actin细胞染色结果显示,C02在20μM、40μM浓度时可成不同程度降低JS-1细胞F-actin的表达;原代小鼠肝星状细胞的油红染色实验结果显示,C02可显着增加原代肝星状细胞胞质内脂滴含量。RAW264.7巨噬细胞经100 ng/m L LPS处理激活造模,采取不同浓度C02干预,荧光定量PCR结果显示,较模型做相比,C02在10μM浓度时TGF-β1、IL-1、PDGF等相关炎性因子较模型组m RNA表达下降（P<0.01或P<0.05）;Elisa结果显示,5μM和10μM C02可在2 h-36 h内持续降低巨噬细胞分泌PDGF-BB的含量（P<0.05）,2.5μM、5μM和10μM C02可在8 h-36 h内持续降低巨噬细胞i NOS分泌量（P<0.05）;C02对巨噬细胞的起效浓度较对HSCs的起效浓度低2-16倍。（4）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:RAW264.7巨噬细胞与JS-1细胞共培养:LPS激活的RAW264.7巨噬细胞给予C02及STAT1抑制剂干预24h,去药后与JS-1细胞共培养24 h,模型组JS-1细胞α-SMA m RNA表达水平明显升高（P<0.05）,C02干预后,高剂量组α-SMA m RNA表达下调（P<0.05）,细胞爬片免疫荧光α-SMA检测也得到同样的结果;Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组可抑制JS-1细胞p-ERK/ERK的蛋白表达（P<0.01或P<0.05）。STAT1抑制剂组可抑制JS-1细胞α-SMA、COL-I m RNA的表达水平,STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）;STAT1抑制剂及C02可抑制M1型巨噬细胞标志物CD11b及PDGF m RNA表达水平,且STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）。4.结论:（1）体内药效学研究表明C02可有效改善CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型的肝功能及纤维化程度,C02可以抑制M1型巨噬细胞及HSCs活化,同时发现C02在体内的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。（2）体外实验研究表明C02可能通过抑制STAT1进而抑制M1型巨噬细胞活化,从而减少PDGF-BB、TNF-α等因子释放,进而抑制HSCs的活化,其抑制HSCs活化的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。
二、慢性肝病发病机制的基础研究有待深入（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性肝病发病机制的基础研究有待深入（论文提纲范文）
（1）芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 表1 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝纤维化的研究现状 |
| 1.1.1 化学合成药物抗肝纤维化研究进展 |
| 1.1.2 中药抗肝纤维化研究进展 |
| 1.2 肝纤维化的诱发因素 |
| 1.3 肝纤维化的发展机理 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号靶点 |
| 1.4.1 TGF-β/smads调控肝纤维化 |
| 1.4.2 PI3K/Akt/mTOR调控肝纤维化 |
| 1.4.3 TLR4/My D88/NF-kB调控肝纤维化 |
| 1.4.4 FXR/SHP/LXR调控肝纤维化 |
| 1.5 本研究的目的 |
| 第二章 芝麻素通过介导 FXR/SHP 信号交互调控炎症减轻肝纤维化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 血清AST/ALT的测定 |
| 2.3.3 制备肝脏切片 |
| 2.3.4 H&E染色 |
| 2.3.5 Masson染色 |
| 2.3.6 Sirius Red染色 |
| 2.3.7 IHC染色 |
| 2.3.8 组织免疫荧光 |
| 2.3.9 实验细胞的培养 |
| 2.3.10 细胞生存率检测 |
| 2.3.11 细胞荧光染色检测 |
| 2.3.12 细胞基因沉默实验 |
| 2.3.13 蛋白印迹实验 |
| 2.3.14 qRT-PCR检测 |
| 2.3.15 统计学处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SES改善血清生化指标升高及组织病理学变化 |
| 2.4.2 SES改善小鼠肝脏胶原沉积 |
| 2.4.3 SES增强FXR/SHP信号干预肝纤维化 |
| 2.4.4 SES抑制肝纤维化中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.5 SES抑制TGF-β诱导的HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 2.4.6 SES抑制HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.7 SES调控FXR介导的SHP信号抑制HSCs的激活 |
| 2.4.8 SES通过siFXR介导SHP减少HSCs的活化 |
| 2.4.9 SES通过调控si SHP介导FXR减少HSCs的活化 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 芝麻酚靶向FXR/LXR信号交互参与巨噬细胞和肝星状细胞串扰改善肝纤维化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物模型建立 |
| 3.3.2 血清AST/ALT测定 |
| 3.3.3 制备石蜡切片 |
| 3.3.4 HE染色 |
| 3.3.5 Masson染色 |
| 3.3.6 Sirius Red染色 |
| 3.3.7 组织免疫荧光染色 |
| 3.3.8 实验细胞培养 |
| 3.3.9 细胞生存率检测 |
| 3.3.10 细胞荧光染色检测 |
| 3.3.11 细胞基因沉默实验 |
| 3.3.12 蛋白印迹实验 |
| 3.3.13 qRT-PCR检测 |
| 3.3.14 RT-PCR检测 |
| 3.3.15 统计学处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DER改善血清生化指标及组织病理学的改变 |
| 3.4.2 DER改善肝纤维化中胶原累积 |
| 3.4.3 DER抑制TAA诱导的小鼠肝脏炎症 |
| 3.4.4 DER参与FXR/LXR信号介导的自噬改善肝纤维化 |
| 3.4.5 DER改善TAA或 RA诱导的血清生化指标及病理学的改变 |
| 3.4.6 DER抑制肝脏自噬 |
| 3.4.7 DER抑制TAA诱导的炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.8 DER抑制活化HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 3.4.9 DER减少活化HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.10 DER调控FXR/LXR和自噬信号逆转HSCs的激活 |
| 3.4.11 DER作用同3-MA抑制HSCs的自噬及炎症因子的表达 |
| 3.4.12 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞自噬 |
| 3.4.13 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞炎症的表达 |
| 3.4.14 DER通过siATG7 抑制自噬减少肝星状细胞的激活 |
| 3.4.15 DER调节FXR/LXRα及炎症因子在基因水平上的表达 |
| 3.4.16 DER激活FXR抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.17 DER激活LXRs抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.18 FXR/LXR参与巨噬细胞和肝星状细胞间的串扰 |
| 3.4.19 DER靶向FXR/LXR交互参与细胞串扰抑制肝星状细胞激活 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 发表论文 |
| 附录2 研究生期间获奖情况 |
（2）DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 DNMT3A 介导 ANRIL 甲基化在肝纤维化与 HSCs增殖中的分子作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 全文总结 |
| 本论文的创新性及特色 |
| 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 综述 表观遗传调控肝纤维化中炎症与HSCs激活:聚焦DNA甲基化和组蛋白修饰 |
| 参考文献 |
（3）基于MAPK-ERK-TLRs通路探讨脂必泰对非酒精性脂肪性肝病的作用机制及临床疗效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究及理论探讨 |
| 1.1 现代医学对NAFLD的研究概况 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 发病机制 |
| 1.1.3 NAFLD常用的诊断方法 |
| 1.1.4 NAFLD的西医治疗现状 |
| 1.2 祖国医学对NAFLD的研究概况 |
| 1.2.1 病名 |
| 1.2.2 病因病机 |
| 1.2.3 辨证分型 |
| 1.2.4 中医辨证施治在NAFLD患者中的应用 |
| 1.2.5 专方治疗在NAFLD患者中的应用效果 |
| 1.2.6 复方治疗在NAFLD患者中的应用效果 |
| 1.2.7 其他方法在NAFLD患者中的应用效果 |
| 1.3 脂必泰来源与组方思路 |
| 第二章 脂必泰对非酒精性脂肪性肝病大鼠的影响及作用机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验药物与主要试剂及耗材 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养管理 |
| 2.3.2 疾病模型建立、模型验证及实验分组 |
| 2.3.3 剂量设计 |
| 2.3.4 检测指标 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 临床观察 |
| 2.4.2 脂必泰对动物体重增长的影响 |
| 2.4.3 脂必泰对血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数的影响 |
| 2.4.4 对血清生化指标和脏器系数的影响 |
| 2.4.5 对肝脏组织病理的影响(大体解剖观察、肝脏组织HE染色、油红O染色) |
| 2.4.6 脂必泰对血清纤维化指标及组织病理纤维指标的影响 |
| 2.4.7 对TLR4、P-ERK1/2、ERK1/2 蛋白的影响 |
| 2.5 讨论及结论 |
| 2.5.1 NAFLD模型建立评价 |
| 2.5.2 脂必泰对NAFLD大鼠血脂、血糖代谢的治疗效果 |
| 2.5.3 脂必泰对NAFLD大鼠血清纤维化指标及组织病理纤维指标的影响 |
| 2.5.4 脂必泰对NAFLD大鼠肝组织TLR4、P-ERK1/2、ERK1/2 蛋白和TLR4、ERK m RNA表达水平的影响 |
| 第三章 脂必泰对非酒精性脂肪性肝病患者的治疗作用评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.3 病例选择 |
| 3.3.1 诊断标准 |
| 3.3.2 纳入标准 |
| 3.3.3 排除标准 |
| 3.3.4 治疗方案 |
| 3.3.5 疗效评价指标 |
| 3.4 统计分析方法 |
| 3.5 研究结果 |
| 3.5.1 临床试验实施概况 |
| 3.5.2 主要疗效指标:肝脏脂肪衰减(CAP)、肝脏硬度(LSM)、体重及BMI指数 |
| 3.5.3 次要疗效指标:肝功能、血脂、血糖和胰岛素抵抗指数 |
| 3.6 安全指标的评估 |
| 3.7 讨论及结论 |
| 3.7.1 NAFLD患者进行基础治疗的效果 |
| 3.7.2 脂必泰结合基础治疗对NAFLD患者体重、BMI、LSM、CAP的效果 |
| 3.7.3 脂必泰结合基础治疗对NAFLD患者血糖及胰岛素的效果 |
| 3.7.4 脂必泰结合基础治疗对NAFLD患者肝功能、血脂的效果 |
| 结语 |
| 4.1 论文研究成果 |
| 4.2 不足之处 |
| 4.3 下一步工作设想 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 HBX与线粒体功能障碍的相关研究 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 HBx蛋白 |
| 1.3 HBx致线粒体损害 |
| 1.3.1 参与线粒体氧化应激 |
| 1.3.2 调节胞浆Ca2+信号转导 |
| 1.3.3 引发线粒体自噬 |
| 1.3.4 促进细胞凋亡 |
| 1.4 展望 |
| 2 卟啉及血红素合成与代谢 |
| 2.1 卟啉及卟啉类化合物 |
| 2.2 血红素及其合成途径 |
| 2.3 血红素合成关键酶 |
| 2.3.1 ALAS |
| 2.3.2 FECH |
| 2.4 卟啉转运蛋白 |
| 2.5 原卟啉(PPⅨ) |
| 2.6 卟啉代谢异常相关疾病 |
| 3 卟啉代谢与慢性肝病的研究进展 |
| 3.1 卟啉代谢与慢性乙型病毒性肝炎 |
| 3.2 卟啉代谢与慢性丙型病毒性肝炎 |
| 3.3 卟啉代谢与肝硬化 |
| 3.4 卟啉代谢与肝细胞癌 |
| 3.5 慢性肝病卟啉代谢异常的治疗 |
| 3.6 展望 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入及排除标准 |
| 1.2.1 病例组 |
| 1.2.2 对照组 |
| 1.3 主要仪器试剂 |
| 1.3.1 主要仪器与设备 |
| 1.3.2 主要实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 一般资料收集 |
| 1.4.2 血清样品采集及保存 |
| 1.4.3 常规实验室检测 |
| 1.4.4 影像学检查 |
| 1.4.5 血清PPⅨ浓度检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝病组和对照组基本资料比较 |
| 2.2 血清PPⅨ检测结果 |
| 2.3 PPⅨ诊断HBV相关慢性肝病的效能 |
| 2.4 不同肝病组间实验室指标比较 |
| 2.5 CHB患者静止期与健康对照组PPⅨ及肝功比较 |
| 2.6 不同患者PPⅨ与各指标的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PPⅨ与肝脏疾病的关系 |
| 3.2 HBV相关慢性肝病患者血清PPⅨ的表达及意义 |
| 3.3 PPⅨ诊断HBV相关慢性肝病的效能 |
| 3.4 PPⅨ与肝功能指标的相关性 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 :抗纤软肝颗粒治疗慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化痰瘀互结型临床回顾性对照研究 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :基于网络药理学探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化药理作用机制 |
| 1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制实验研究 |
| 实验一 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 实验二 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附件一:攻读学位期间的研究成果 |
| 附件二:综述 肝纤维化中西医诊断与防治最新研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）泽泻汤化学成分及抗非酒精性脂肪肝谱效关系研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 泽泻汤化学成分及其调血脂机制研究进展 |
| 1. 泽泻汤化学成分研究进展 |
| 2. 泽泻汤调血脂机制研究 |
| 3. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 非酒精性脂肪肝发病机制和治疗的研究进展 |
| 1. 西医治疗非酒精性脂肪肝的相关阐述 |
| 2. 中医药治疗非酒精性脂肪肝的相关概述 |
| 3. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于LC-MS的泽泻汤物质基础及体内成分研究 |
| 第一节 基于LC-MS的泽泻汤物质基础研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 基于LC-MS的泽泻汤体内化学成分研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 泽泻汤抗非酒精性脂肪性肝及其作用机制研究 |
| 第一节 泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 泽泻汤抗非酒精性脂肪肝谱效关系研究 |
| 第一节 泽泻汤化学指纹图谱的建立 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 泽泻汤抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积作用研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第三节 泽泻汤抗非酒精性脂肪肝谱效关系研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于分子对接技术的泽泻汤抗非酒精性脂肪肝药效成分确证及机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）非生物型人工肝联合肝移植治疗乙肝慢加急性肝衰竭患者的临床疗效及短期预后转归（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 入选与排除标准 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 治疗方法 |
| 1.4 观察指标与随访终点 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 所有患者入组时的基线特征 |
| 2.2 ALSS治疗方法及治疗的疗效分析 |
| 2.3 ALSS治疗对术前、术中及术后相关指标的影响 |
| 2.4 两组患者短期生存分析 |
| 2.5 预后影响因素分析 |
| 2.6 各评分系统对移植术后短期预后(4W生存)的预测价值 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)的诊治进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）中医药治疗PBC的系统评价及通胆汤干预TAM分子家族治疗PBC的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 现代医学对原发性胆汁性胆管炎的认识 |
| 一、PBC的流行病学 |
| 二、PBC的疾病自然史 |
| 三、PBC发病机制研究 |
| 四、PBC患者血清中的自身抗体 |
| 五、特殊类型的PBC |
| 六、PBC的生化应答标准 |
| 七、PBC的治疗 |
| 第二节 TAM受体家族分子的相关研究 |
| 一、TAM受体家族分子结构及功能 |
| 二、TAM受体家族分子研究进展 |
| 三、TAM受体家族分子与PBC的关系 |
| 第三节 PBC中医研究进展 |
| 一、中医对PBC的认识 |
| 二、中医对PBC的治疗 |
| 三、中医治疗PBC的现代研究 |
| 第二章 中医药治疗PBC的系统评价 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 一、纳入标准 |
| 二、排除标准 |
| 三、评价指标 |
| 四、检索策略 |
| 五、质量评价 |
| 六、统计分析方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、文献检索结果 |
| 二、纳入研究基本信息 |
| 三、纳入研究质量评估 |
| 四、纳入研究数据提取 |
| 五、结局指标的meta分析 |
| 第四节 讨论 |
| 一、方法质量学 |
| 二、研究对象 |
| 三、疗效指标 |
| 四、临床意义 |
| 第五节 总结 |
| 第六节 结论 |
| 第三章 通胆汤对PBC患者疗效及血清游离TAM家族分子的影响 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 资料与方法 |
| 一、一般资料 |
| 二、诊断标准 |
| 三、纳入标准 |
| 四、排除标准 |
| 五、中医证型辨证 |
| 六、治疗方案 |
| 七、资料采集 |
| 八、观察指标 |
| 九、疗效判定标准 |
| 十、统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、两组患者一般资料比较 |
| 三、两组患者自身抗体情况比较 |
| 四、患者中医证型分布情况 |
| 五、两组患者治疗前后肝脏酶学指标分析 |
| 六、两组患者治疗前后Firbscan水平检测 |
| 七、两组患者治疗前后TAM家族分子水平分析 |
| 八、两组患者早期应答累积发生率的生存分析 |
| 九、两组患者平均早期应答时间比较 |
| 十、PBC主要酶学指标与TAM家族分子相关性分析 |
| 十一、Firbscan与TAM家族分子相关性分析 |
| 十二、Axl、Mertk、Tyro-3、Gas6、Protein S评估工具的ROC曲线 |
| 十三、患者早期应答发生的相关因素分析 |
| 十四、不良反应 |
| 第四节 讨论 |
| 一、通胆汤对PBC患者肝脏功能及早期应答的影响 |
| 二、通胆汤对PBC患者血清游离TAM受体家族分子的影响 |
| 三、TAM受体家族分子与PBC之间的关系 |
| 第五节 总结 |
| 第六节 结论 |
| 第四章 通胆汤干预TAM家族分子治疗PBC小鼠的作用机制 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、方法 |
| 三、主要实验步骤 |
| 四、统计学方法 |
| 五、技术路线 |
| 第三节 结果 |
| 一、小鼠随机抽样结果 |
| 二、小鼠随机分组结果 |
| 三、对照组及模型组小鼠外观形体、肝脏外观比较 |
| 四、对照组及模型组小鼠体重及肝脏指数比较 |
| 五、各组小鼠AMA-M2阳性率比较 |
| 六、各组小鼠肝生化指标比较 |
| 七、各组小鼠肝脏病理图片(HE染色 & Sirius red) |
| 八、TAM受体家族分子蛋白表达情况 |
| 九、TAM受体家族分子蛋白qPCR检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、聚肌胞诱导可成功建立小鼠PBC模型 |
| 二、通胆汤对PBC小鼠肝脏酶学指标、病理的影响 |
| 三、通胆汤对PBC小鼠TAM受体家族分子的影响 |
| 第五节 总结 |
| 第六节 结论 |
| 不足及展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生在校期间发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 C02对CCl_4诱导肝纤维化小鼠的干预作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型制备方法 |
| 2.2 血清肝功能检测 |
| 2.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.4 肝组织HE染色 |
| 2.5 肝组织天狼猩红染色及胶原半定量 |
| 2.6 肝组织羟脯氨酸含量 |
| 2.7 肝组织和细胞总RNA抽提 |
| 2.8 Real time PCR |
| 2.9 免疫组织化学染色 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组小鼠基本情况 |
| 3.2 小鼠体重、肝重、脾重、肝体比及脾体比的变化情况 |
| 3.3 C02对CCl_4 肝纤维化小鼠血清ALT、AST的影响 |
| 3.4 C02对CCl_4肝纤维化小鼠肝组织病理学及羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.5 C02对CCl_4 肝纤维化小鼠肝脏α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.6 C02对CCl_4诱导肝纤维化小鼠肝内巨噬细胞表型的影响 |
| 3.7 C02 对促纤维化相关因子PDGF-BB、TNF-α表达的影响 |
| 3.8 C02对JNK/ERK/P38 信号通路的影响 |
| 3.9 C02 对巨噬细胞活化相关蛋白IRF5、STAT1 的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型制备方法 |
| 2.2 血清肝功能检测 |
| 2.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.4 肝组织HE染色 |
| 2.5 肝组织羟脯氨酸含量 |
| 2.6 肝组织和细胞总RNA抽提 |
| 2.7 Real time PCR |
| 2.8 免疫组织化学染色 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠基本情况 |
| 3.2 大鼠体重、肝重、脾重、肝体比及脾体比的变化情况 |
| 3.3 C02对DMN肝纤维化大鼠血清ALT、AST含量的影响 |
| 3.4 C02对DMN纤维化大鼠肝组织病理及羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.5 C02对DMN肝纤维化大鼠肝脏α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.6 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝内巨噬细胞表型的调控作用 |
| 3.7 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝脏促纤维化因子PDGF-BB、TNF-α表达的影响 |
| 3.8 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝脏JNK/ERK/P38 信号通路的影响 |
| 3.9 C02对巨噬细胞活化相关蛋白的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 C02对肝星状细胞及巨噬细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 分离原代小鼠肝星状细胞 |
| 2.3 原代肝星状细胞存活率鉴定 |
| 2.4 原代肝星状细胞的纯度鉴定 |
| 2.5 细胞免疫荧光检测 |
| 2.6 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.7 Real Time PCR |
| 2.8 蛋白免疫印迹 |
| 2.9 ELISA检测 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 C02对JS-1细胞活力及增殖的影响 |
| 3.2 C02对JS-1 细胞α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.3 C02 对小鼠原代肝星状细胞α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.4 C02对巨噬细胞的增殖及活力的影响 |
| 3.5 C02 对巨噬细胞分泌相关炎性因子PDGF-BB、TNF-α、TGF-β1、IL-1 mRNA的影响 |
| 3.6 C02 对巨噬细胞分泌PDGF-BB、TNF-α、iNOS的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 C02通过巨噬细胞影响肝星状细胞的活化 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 Transwell细胞共培养 |
| 2.3 细胞免疫荧光检测 |
| 2.4 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.5 Real Time PCR |
| 2.6 蛋白免疫印迹 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 共培养不同时间点巨噬细胞对肝星状细胞的活化影响 |
| 3.2 共培养24h巨噬细胞CD11b、CD206 表达变化 |
| 3.3 共培养24h巨噬细胞PDGF-BB、TNF-α、TGF-β1、IL-1 mRNA的变化 |
| 3.4 共培养24h培养上清中PDGF-BB、TNF-α蛋白含量变化 |
| 3.5 共培养24h巨噬细胞IRF-5、STAT1 mRNA表达变化 |
| 3.6 共培养24h巨噬细胞对肝星状细胞的活化影响 |
| 3.7 共培养24h对 JS-1 细胞ERK、P-ERK的影响 |
| 3.8 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞STAT1 mRNA变化情况 |
| 3.9 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞CD11b、CD206 mRNA的表达变化 |
| 3.10 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞分泌促炎因子PDGF-BB、TNF-α变化情况 |
| 3.11 STAT1抑制剂干预后肝星状细胞的活化情况 |
| 4 本章小结 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 本文的创新点 |
| 附录1 :文献综述 肝脏微环境中各种细胞对肝星状细胞活化的影响 |
| 参考文献 |
| 附录2:在校期间发表的学术论文 |
四、慢性肝病发病机制的基础研究有待深入（论文参考文献）
- [1]芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究[D]. 侯丽爽. 延边大学, 2021(02)
- [2]DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制[D]. 杨晶晶. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]基于MAPK-ERK-TLRs通路探讨脂必泰对非酒精性脂肪性肝病的作用机制及临床疗效研究[D]. 廖媛. 广州中医药大学, 2020(09)
- [4]HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义[D]. 张璎. 西安医学院, 2020(08)
- [5]基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制[D]. 许杰. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [6]泽泻汤化学成分及抗非酒精性脂肪肝谱效关系研究[D]. 常晓燕. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [8]非生物型人工肝联合肝移植治疗乙肝慢加急性肝衰竭患者的临床疗效及短期预后转归[D]. 李朋. 浙江大学, 2020(02)
- [9]中医药治疗PBC的系统评价及通胆汤干预TAM分子家族治疗PBC的作用机制[D]. 姜小艳. 广州中医药大学, 2019(08)
- [10]虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究[D]. 徐莹. 上海中医药大学, 2019(03)
标签：对照组论文; 慢性肝病论文; 肝纤维化指标检查论文; 肝病饮食论文; 血清蛋白论文;