一、弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达（论文文献综述）
王晓星[1]（2021）在《羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究》文中研究表明羊巴贝斯虫病是一种蜱传性（tick-borne）血液原虫病,临床特征包括发热、血红蛋白尿和溶血性贫血等。目前,研究表明我国羊巴贝斯虫分布广泛、动物感染率高,严重危害我国养羊业的健康可持续发展。自噬（autophagy）是细胞在自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）的调控下,依赖溶酶体途径对长寿蛋白或受损细胞器进行降解的一种过程。近年来,研究表明ATGs不仅参与调控疟原虫和弓形虫自噬的发生,而且在维持顶质体、线粒体等细胞器的稳态及虫体的生长复制过程中起关键作用,同时也与耐药虫株（双氢青蒿素、氯喹和哌嗪等抗疟药物）的产生存在潜在的关系。巴贝斯虫、疟原虫和弓形虫等同属于顶复门原虫,但迄今为止,尚未见巴贝斯虫中是否存在自噬系统及其ATGs结构与功能的研究报道。因此,本研究以羊巴贝斯虫未定种新疆株（Babesia sp.Xinjiang,BspXJ）为研究对象,通过对梨形虫ATGs进行生物信息学分析、测定羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组、评价自噬抑制剂和诱导剂对ATGs表达丰度的影响、建立羊巴贝斯虫基因编辑技术和分析ATGs亚细胞定位及鉴定互作蛋白等工作,为深入开展巴贝斯虫ATGs功能的研究提供了基础数据,同时为利用基因编辑技术开展巴贝斯虫基因功能的研究建立了技术平台。主要研究结果总结如下:1.通过对梨形虫ATG的生物信息学分析,表明巴贝斯虫基因组中仅存在部分核心ATGs,包括ATG3、ATG4、ATG7、ATG8、ATG18和Vps34,其中ATGs蛋白的催化或结合位点在不同物种中高度保守,同时也显示其适于作为顶复门原虫进行分类研究的分子靶标;其次对羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组进行测定,结果显示其基因组大小分别为29916–30846 bp和5767–5946bp,以其基因组构建的系统进化树均表明我国羊巴贝斯虫可分为羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）,其中莫氏巴贝斯虫又分为两个亚种,该结果为后续ATGs基因功能的研究提供细胞器基因组数据。2.通过瞬时转染筛选最佳转染条件,结果表明最佳转染缓冲液、程序和质粒用量分别为Human T Cell nucleofector solution、V-024和20μg,启动子活性为Actin IG>ef1αAIG>ef1αBIG>Rap IG,在瞬时转染成功的基础上使用同源重组技术,将e GFP-杀稻瘟菌素（Blasticidin,BSD）融合蛋白插入BspXJ基因组的ef1α位点,经PCR、WB和IFA鉴定,结果显示获得稳定表达e GFP-BSD融合蛋白的单克隆虫株,表明成功建立了BspXJ瞬时和稳定转染系统,为后续研究基因功能提供了技术支持。3.制备BspXJ的ATGs多克隆抗体,经WB分析,结果显示天然ATG蛋白的表达量较低;利用建立的稳定转染系统,构建过表达ATGs的BspXJ虫株,经q PCR、PCR、WB和IFA鉴定过表达ATGs的虫株,结果显示成功获得过表达ATG3和ATG8的BspXJ虫株;然后通过IFA和Co-IP等方法进行ATG3和ATG8蛋白的亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定,结果表明ATG3和ATG8与顶质体和线粒体均部分共定位,与其互作的蛋白主要参与调控自噬、泛素降解、入侵和线粒体主要功能等生物学过程。4.通过筛选BspXJ自噬抑制剂和诱导剂的最佳作用浓度,应用q PCR检测自噬抑制剂和诱导剂处理后不同时间点ATGs的表达丰度,结果显示最佳作用浓度依次为2 m M 3-甲基腺嘌呤、12.5n M巴非霉素A1、12.5μM氯喹和5μM雷帕霉素,HBSS和雷帕霉素自噬诱导剂处理后,均可增高ATGs的表达丰度,其中ATG8表达量增加3–26.5倍,而自噬抑制剂处理后,ATGs表达丰度降低/增高倍数小于1,表明BspXJ的ATGs参与调控其自噬过程。5.利用同源重组技术敲除ATG3和ATG8后,经过多轮筛选均未获得稳定转染的基因敲除虫株,结果表明ATG3和ATG8是BspXJ生长复制过程中的关键基因;为进一步研究其基因功能,稳定表达TIR1-3Flag的虫株中转染p BS-m Cherry-AID-3HA质粒,成功筛选获得稳定表达m CherryAID-3HA的虫株。在加入400μM IAA 4 h时,WB和IFA检测结果显示m Cherry-AID-3HA蛋白的表达水平显着降低,表明成功建立了BspXJ的条件性基因敲除系统,从而为将来开展ATG3和ATG8作用机制的研究提供了技术平台。综上所述,本研究成功建立了BspXJ的瞬时、稳定转染及条件性基因敲除技术,初步阐明了虫体内存在自噬途径,且其ATGs参与调控自噬途径,为深入开展巴贝斯虫自噬相关基因的作用机制提供了基础数据,同时为开展巴贝斯虫入侵、繁殖、致病、代谢等方面机制的研究提供了技术平台。
杨承杭[2]（2021）在《弓形虫UTPG基因的生物学功能研究》文中研究表明弓形虫是一种专性胞内寄生原虫,感染宿主广泛,严重危害人类健康,影响动物食品生产。弓形虫中许多蛋白质需要经过翻译后修饰才能发挥相应功能,由糖基转移酶家族介导的蛋白质翻译后修饰在弓形虫的糖基化修饰过程中起着主要作用。过去,关于弓形虫中蛋白质糖基化修饰的研究主要集中于糖基转移酶类家族,却对糖基化修饰过程中糖基供体是如何产生的知之甚少。UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-Glc Nac）由UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶催化生成,UDP-N-乙酰葡萄糖胺是弓形虫N-糖基化及Skp1糖基化过程中的首位糖基供体,也是其他糖基化修饰过程中重要的单糖供体之一,对弓形虫蛋白质糖基化修饰的形成有至关重要的作用,但在弓形虫中负责催化生成UDP-Glc Nac的酶类尚未表征。本研究通过生物信息学分析的手段,发现弓形虫中存在着糖核苷酸合成途径,进而通过氨基酸序列比对及表型值筛选,找到了弓形虫中潜在的UDP-Glc Nac焦磷酸化酶（Tg ME49＿264780）。根据其在数据库中的注释,将其命名为UTPG,以UTPG基因为研究对象,采用遗传学等方法来研究UTPG基因在弓形虫生长发育过程中的生物学功能,具体包括以下3各方面:（1）UTPG基因对于弓形虫体内生长发育的影响用CRISPR/CAS9基因编辑技术及TIR1生长素诱导条件降解蛋白系统相结合对UTPG基因进行了条件性敲除,进行了条件性敲除虫株及回补虫株的构建,对获得的敲除株进行了一系列表型实验,发现UTPG基因的缺失影响了弓形虫正常的体内生长发育,缺失UTPG基因对弓形虫来说是致死的。（2）UTPG基因中氨基酸位点对于其发挥生物学功能的影响通过对UTPG基因所表达的蛋白质的氨基酸序列中关键氨基酸位点进行突变,发现G330位点的突变（G330A）回补不能救援UTPG基因缺失造成的表型缺陷,同样会造成弓形虫的死亡,而R334A及K341A位点的突变回补则能够救援UTPG基因缺失造成的生长表型缺陷,说明了G330位点对于UTPG基因发挥正常的生物学功能至关重要,而R334A及K341位点则不是很重要。（3）UTPG基因是弓形虫中潜在的UDP-Glc Nac焦磷酸化酶通过异源回补酵母中的UDP-Glc Nac焦磷酸化酶（UAP1）基因,发现异源回补酵母的UAP1基因可以支持弓形虫缺失UTPG基因后虫体的正常发育,并且可以完全恢复之前的表型缺陷,说明了UTPG基因是弓形中潜在的UDP-Glc Nac焦磷酸化酶。综上所述,本研究通过条件性敲除UTPG基因,构建点突变回补虫株及异源回补虫株等方式,对构建的单克隆虫株进行了表型研究,发现UTPG基因对弓形虫正常的生长发育十分重要,其中G330位点是UTPG基因发挥生物学功能的关键氨基酸位点,同时UTPG基因具有潜在的UDP-Glc Nac焦磷酸化酶催化活性,其催化产生的UDP-Glc Nac是弓形虫糖基化修饰过程中必不可少的。这些结果说明了弓形虫参与催化形成UDP-Glc Nac的UDPGlc Nac焦磷酸化酶对弓形虫生长发育的重要性,为进一步了解弓形虫的糖基化修饰奠定基础,更为针对糖基化修饰的相关途径开发新型药物提供了新思路。
张晶雯[3]（2020）在《AP2X-4和AP2XⅡ-5对弓形虫生长发育的调节作用》文中进行了进一步梳理弓形虫是一种专性的胞内寄生原虫,主要感染包括人类在内的所有温血动物,导致流产、死胎等严重危害。弓形虫具有复杂的生活史,包括在终末宿主猫体内的有性繁殖和中间宿主体内的无性繁殖阶段,无性繁殖阶段又包括急性感染期虫体快速繁殖的速殖子阶段和慢性感染期的缓殖子阶段。不同阶段的虫体具有不同的生物学特征,它们在虫体传播和致病过程中扮演了关键的角色,但是我们对虫体由一个阶段分化到另一个阶段的分子调控作用还知之甚少。实验室前期通过核蛋白组学技术筛选到两个在速殖子与缓殖子期丰度有差异的转录因子,AP2X-4及AP2XⅡ-5。本研究围绕这两个蛋白的功能开展研究,以了解它们对虫体生长发育的调控作用,具体工作包括以下两个方面:（1）AP2XⅡ-5对生活史中各个阶段基因表达的调控作用实验室前期已经在II型虫株ME49中构建了AP2XⅡ-5的缺失株。本研究首先获得了AP2XⅡ-5的特异性抗体并验证了AP2XⅡ-5缺失株的有效性。此外,对Δap2XⅡ-5虫株进行RNA-seq分析发现,AP2XⅡ-5的缺失导致虫体阶段特异性基因表达紊乱,基因的表达紊乱导致弓形虫毒力下降及缓殖子复制能力减弱。DNA结合实验证明AP2XⅡ-5的AP2功能域能够与缓殖子时期特异表达的乳酸脱氢酶2（LDH2）的启动子序列特异性结合。这些结果表明AP2XⅡ-5转录因子可通过与目标基因启动子结合来调控弓形虫生活史各阶段基因的有序表达从而影响虫株毒力。（2）AP2X-4对棒状体分泌蛋白表达的调控作用AP2X-4在缓殖子时期的转录水平高于速殖子时期,因此我们猜测它可能调控缓殖子的分化发育,但遗传学研究表明它对弓形虫速殖子的生长非常重要。在II型虫株ME49中敲除AP2X-4,体外表型实验发现缺失AP2X-4后,虫体的入侵和生长受到明显影响。RNA-seq表明AP2X-4的缺失影响棒状体分泌蛋白的表达,其中包括一些如RON4、RON5等虫体入侵宿主细胞的关键蛋白。此外,AP2X-4还调节慢性感染期特异性表达的基因,例如BAG1和LDH2。鉴于AP2X-4对入侵和缓殖子分化相关基因的调节作用,它的失活导致了弓形虫毒力的急剧减弱及脑包囊形成缺陷。弓形虫基因组编码67个AP2转录因子,本研究通过对AP2XⅡ-5和AP2X-4的分析发现AP2转录因子对虫体的生命活动有广泛的调节作用,且不同的转录因子有不同的调控目标,AP2XⅡ-5抑制有性生殖阶段特异性基因在速殖子时期的表达,进而影响虫株的毒力。AP2X-4则主要通过调节棒状体分泌蛋白的表达来调控虫体对宿主细胞的入侵,从而影响虫体的生长和毒力。
范俊杰[4]（2020）在《细粒棘球绦虫原头蚴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达》文中研究指明囊型棘球蚴病（Cystic echinococcosis,CE）是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）的幼虫棘球蚴引起的一种易被忽视的慢性人畜共患寄生虫病。该病严重危害人类健康,给畜牧业造成了巨大的经济损失。然而,由于对棘球蚴生长、发育、囊液的形成途径缺乏深入的认识,目前对棘球蚴病的防治一直缺乏创新的方法。本研究首先通过转录组测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）检测细粒棘球绦虫原头蚴（Protoscoleces,PSCs）体外培养不同发育时期的基因转录表达水平,筛选在原头蚴囊化形成棘球蚴过程中具有显着上调的差异表达基因进行KEGG、GO数据库富集分析。结果发现血管加压素调节的水重吸收代谢通路与囊液形成密切相关,而该通路主要是由蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）介导囊泡转运过程来运输水及小分子物质。然后,扩增EgPKA基因序列并利用生物信息学方法预测其理化性质,亚细胞定位,二、三级结构,抗原表位和密码子使用偏好性。结果表明,与NCBI参考序列相比,EgPKA编码区417-464 bp缺失48 bp,全长1053bp,编码350个氨基酸。通过序列比对分析发现突变后的EgPKA特征性保守区域并未改变,如ATP结合位点（GTGSFGRV）、丝/苏氨酸激活位点（RDLKPEN）、PKA调节亚基结合位点（LCGTPEY）。此外,EgPKA蛋白具有多个抗原表位及较好的免疫反应性。最后,克隆EgPKA基因,并在毕赤酵母中构建重组菌株GS115/pPIC9K-EgPKA,纯化目的蛋白后研究其与血清抗体的免疫反应性。结果显示重组菌株在1.0%甲醇浓度下培养72 h可获得最优蛋白产量;NI-NTA树脂纯化的目的蛋白与免疫血清有特异性反应。此外,通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,QPCR）检测EgPKA基因转录表达水平,结果发现EgPKA在体外培养不同发育时间的原头蚴和在感染原头蚴的小鼠体内不同发育时间的棘球蚴囊壁组织中的表达趋势相同,均呈上升趋势。本研究首次报道细粒棘球绦虫原头蚴囊化形成棘球蚴过程中的转录组学信息;发现和验证了EgPKA编码区序列发生了基因缺失突变;成功构建EgPKA真核表达体系,诱导表达的重组蛋白具有较好的免疫反应性,有成为抗细粒棘球蚴病临床诊断抗原的潜在价值,本研究为棘球蚴液的形成机制奠定基础。
潘明[5]（2019）在《弓形虫致密颗粒和棒状体分泌蛋白的鉴定和功能研究》文中研究指明弓形虫是顶复门寄生虫中一种极具代表性的人兽共患病原。作为单细胞寄生虫,它可以感染几乎所有的温血动物和这些宿主所有的有核细胞。为了适应如此广泛的细胞类型和宿主范围,弓形虫依赖一大批分泌蛋白来介导虫体与宿主的互作,以满足虫体在不同寄生条件下的生长需求。致密颗粒蛋白（GRAs）和棒状体蛋白（ROPs）是其中两类重要的分泌蛋白,在虫体的生长发育和免疫逃避过程中发挥重要作用。截至目前,GRAs的家族成员研究不多,其组分有待挖掘;另一方面,大批ROPs已被发现,但其工作的分子机制并不十分清楚。因此,本研究采用蛋白质标记技术来发掘新的致密颗粒蛋白,用酵母双杂交技术筛选与弓形虫棒状体蛋白互作的宿主蛋白,具体的研究内容包括以下两个方面:（1）新型致密颗粒蛋白的筛选、鉴定和功能研究采用APEX和BirA*这两种基于邻近原则的蛋白标记技术,以已知的致密颗粒蛋白GRA1作为诱饵,我们对弓形虫潜在的GRA蛋白进行了生物素标记,并最终成功鉴定得到46个蛋白,其中包括20个已知的GRA蛋白和26个候选的GRAs。在这46个蛋白中,有17个是APEX和BirA*两种方法共同鉴定得到的,而这17个蛋白中有14个是已知的GRA蛋白,另外3个在本研究中也被证实定位于致密颗粒;另有一些GRA蛋白是仅在一种方法中鉴定得到的,表明APEX和BirA*两方法相互补充。通过定位研究我们对这些候选GRA蛋白进行了鉴定,并确定了其中5个是新型的致密颗粒蛋白;对其中的TGGT1200360和TGGT1319340进行基因敲除,研究表明前者的缺失不会影响虫体的体内外生长,而后者恰恰相反。对这26个候选GRAs在不同顶复门原虫中的同源性进行比对,结果表明大多数的蛋白都具有一个较高的表型评分,且这些蛋白只存在于弓形虫以及与之非常相近的几种寄生虫中;而少部分蛋白的表型值很低,且这些蛋白广泛存在于隐孢子虫、血液原虫等顶复门寄生虫中。因此根据功能推测GRA蛋白可被分为两类:其中一类蛋白保守型相对较高,表型指数低,可能与虫体生长密切相关;另一类像TGGT1200360这样保守性低,表型指数较高,它们不影响虫体的体外生长,可能与虫体适应不同的宿主环境有关。（2）与棒状体蛋白ROP16互作宿主蛋白的筛选和鉴定选取弓形虫ROP16蛋白作为诱饵,在与鼠脑cDNA文库的酵母双杂交中,本研究成功筛选得到了与ROP16互作的两个阳性克隆,后经测序比对确认为鼠源蛋白Dnaja1和Gabra4。根据基因功能分析,ROP16可能通过这两种蛋白参与宿主的免疫反应和神经系统的调节。点对点的酵母双杂交实验进一步验证了ROP16与Dnaja1和Gabra4的相互作用关系,并确定了互作的关键结构域为ROP16的前区Predomain。将ROP16和鼠源基因Dnaja1/Gabra4连接上真核转染载体,成功转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀实验证实了ROP16与Dnaja1的相互作用,再次确认了ROP16的Predomain在介导这两者互作中的关键作用。本研究采用生物素蛋白标记技术成功筛选出26个潜在蛋白并确定了其中5个为弓形虫新型致密颗粒蛋白,用酵母双杂交技术鉴定到了2个与弓形虫ROP16相互作用的宿主蛋白。对GRA蛋白的组分研究进一步加深了我们对弓形虫分泌蛋白的认识,丰富了虫体生长发育和宿主调控的研究内容;对ROP16互作蛋白的研究拓宽了棒状体蛋白的研究思路,揭示了ROP16的潜在功能。该研究聚焦弓形虫的分泌蛋白,对其组分和功能的挖掘有利于进一步解析弓形虫与宿主复杂的相互作用关系以及理解它建立寄生生活的机制。
张玉娟[6]（2019）在《弓形虫重组蛋白SAG1纳米金生物传感器诊断弓形虫病的研究》文中进行了进一步梳理目的:克隆和表达弓形虫截短型主要表面抗原1（tSAG1）,建立诊断弓形虫病的纳米金生物传感器。方法:以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1编码区515位至1267位的核酸序列,克隆至pMD18-T载体,测序鉴定,亚克隆至表达载体pET-28a（+）,诱导表达tSAG1,金属螯合层析纯化,Western blot分析其免疫活性。种子生长法制备金纳米棒（Au NRs）,偶联tSAG1,构建tSAG1-Au NRs生物传感器检测人血清抗弓形虫SAG1抗体;采用非参数检验分析测定值,按大于或等于体检健康者血清红移值的x+2SD判定为阳性,计算敏感度、特异度、预测值和诊断效率。谷胱甘肽法制备金纳米簇,经活化后,与羊抗人IgG连接;将tSAG1包被在微孔板孔内,与人血清弓形虫抗体结合,再与金纳米簇-羊抗人IgG作用,加入柠檬酸三钠溶液及吗啉乙磺酸-水合物溶液稀释的过氧化氢反应30min,再加入氯金酸溶液反应1h,肉眼观察结果,并测定550nm处的吸光度值OD550;采用非参数检验分析测定值,按小于或等于体检健康者血清OD550的x-2SD判定为阳性,计算敏感度、特异度、预测值和诊断效率。结果:构建了tSAG1的表达质粒,表达纯化获得有免疫反应性的tSAG1,分子质量为约30kDa。tSAG1-Au NRs生物传感器的检验敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率依次为80.9%、90.0%、90.2%、80.6%和85.2%。基于金纳米簇模拟酶性质构建的可视化生物传感器的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率依次为80.0%、90.0%、88.9%、81.8%和85.0%。结论:基于重组tSAG1建立的纳米金生物传感器可用于检测弓形虫抗体。
傅勇[7]（2019）在《弓形虫酰基辅酶A结合蛋白功能及其作用机制》文中研究表明龚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是重要的寄生原虫。脂类代谢对弓形虫的生长发育极为重要。已知生物细胞的长链酰基辅酶A可通过酰基辅酶A结合蛋白（acyl-CoA binding protein,ACBP）和甾醇载体蛋白（sterol carrier protein 2,SCP2）转运到不同细胞器参与脂类合成。我们通过数据库比对发现弓形虫存在两种酰基辅酶A结合蛋白,TgACBP1和TgACBP2,也具有甾醇载体蛋白TgSCP2,但未见对弓形虫ACBPs和SCP2的功能和作用机制的研究报道。首先我们证实了弓形虫体内存在ACBP1和ACBP2。通过构建内源性标记虫株,发现ACBP1分布于胞浆;胞内和胞外虫体的ACBP2的定位存在差异,分别定位于线粒体和虫体外膜。胞内虫体的ACBP2处于去磷酸化状态,胞外虫体的ACBP2处于磷酸化状态,高浓度[K+]和低浓度[Ca2+]条件下胞外虫体ACBP2发生去磷酸化;高浓度[K+]条件下胞外虫体ACBP2发生转位。胞外酶活实验显示ACBP1和ACBP2重组蛋白均能够结合NBD-C16:0-CoA,利用酵母回补实验证实TgACBP1和TgACBP2均能够回补AAcb1酵母的液泡表型缺陷,充分说明两种TgACBPs蛋白在体外和细胞内均具有结合脂酰辅酶A的能力。以TATi为母源虫株构建ACBP1条件性基因缺失株,发现正常条件下ACBP1缺失对虫体表型无显着影响,但ACBP1基因缺失虫株摄取脂肪酸的能力显着提高,ATP含量显着下降。薄层层析结果显示ACBP1缺失株的甘油三酯含量明显上升,脂质体数量显着增加。在无葡萄糖培养条件下,ACBP1缺失虫株的增殖和入侵能力显着下降。RT-PCR结果显示ACBP1基因缺失虫株的SCP2转录水平明显升高,SCP2基因缺失虫株的表型无显着变化,ACBP1和SCP2双基因缺失虫株的增殖能力和对小鼠致病性均显着降低。利用色谱质谱联用和同位素标记技术对不同虫株的11种脂肪酸进行分析,发现ACBP1或SCP2单基因缺失株的脂肪酸合成能力无显着变化,但ACBP1和SCP2单基因缺失株的C18:1含量均显着降低;ACBP1和SCP2双基因缺失株的C18:0、C22:1和C24:1的合成能力显着下降,C18:1、C22:1和C24:1含量显着降低,其它8种脂肪酸变化不大。脂质组学分析共鉴定出多种甘油酯和磷脂分子,发现 ACBP1 和 SCP2 双缺失株的 TAG、DAG、CDP-DAG、MAG、PC、PE、PI、CL的总量和不同分子的相对含量均显着降低,PS的总量和不同分子的相对含量显着上升。以上结果充分表明ACBP1和SCP2协同参与长链脂肪酸、甘油酯和磷脂代谢。以RHAKu80为母源虫株,构建ACBP2基因缺失虫株RHAACBP2,发现正常条件下ACBP2基因缺失株的表型无明显变化,在高浓度[K+]作用下虫株的增殖能力显着降低。以Pru为母源虫株,构建ACBP2基因缺失虫株PruAACBP2,发现虫株的增殖能力和对小鼠致病性均显着下降,对ACBP2基因缺失虫株进行不同结构域的回补,发现回补锚蛋白结构域ANK2的突变体恢复了 PruAACBP2的表型,而回补酰基辅酶A结合结构域ACBD的突变体不能恢复PruAACBP2的表型。对不同虫株的活性氧和内膜电势检测发现,正常培养条件RHAACBP2无显着变化,但是在高浓度[K+]作用下线粒体的活性氧升高,内膜电势降低,细胞色素C外流,虫体凋亡率显着上升;PruAACBP2的线粒体活性氧显着增加,内膜电势降低。进一步检测线粒体的特有磷脂—心磷脂,在弓形虫中共鉴定出25种心磷脂,缺失ACBP2的Pru虫株中,10种心磷脂含量均显着降低。将线粒体募集因子MAF1RHb1转入PruAACBP2,使其具有募集宿主细胞线粒体的能力,且回补了PruAACBP2的表型和线粒体内膜电势缺陷。脂质组学分析表明MAF1RHb1的表达对虫体脂肪酸、PC、PE、PI、PS和MLCL的总量无显着影响,但恢复了基因缺失株PA、PG和CL的总量。以上结果表明TgACBP2在Pru虫株的心磷脂代谢中发挥重要作用。综述所述,TgACBP1、TgACBP2和TgSCP2均能结合脂酰辅酶A。ACBP1和SCP2协同参与虫体长链脂肪酸、甘油酯和磷脂代谢;ACBP2参与虫体心磷脂代谢,维持线粒体功能;MAF1RHb1介导的宿主细胞线粒体募集与TgACBP2的心磷脂的代谢密切相关。
刘欣超[8]（2018）在《刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究》文中认为刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种严格的细胞内寄生虫,在弓形虫的生活史中,速殖子可引起中间宿主的急性感染,在这一感染性阶段,无性生殖是其主要的繁殖方式。若没有宿主免疫应答对虫体繁殖的抑制,弓形虫速殖子可以进行不断的繁殖。原癌基因是一些可以影响细胞生长和繁殖的正常细胞基因,一旦他们的表达发生改变,则会促进癌症的发生。那么弓形虫速殖子的不断繁殖与癌细胞的不可控生长有没有关联,目前暂无相关的报道。组蛋白是一种小分子的保守蛋白质,它占染色质总重量的50%,并可以通过修饰调节DNA中所含信息。因而目前弓形虫组蛋白的研究也主要集中于表观遗传学方向,而未见针对组蛋白其他功能研究的报道。在本研究中通过对弓形虫的基因组序列进行分析,分别选取弓形虫酪氨酸激酶样蛋白（Tyrosine kinase-like protein,TKL）,Ras 家族蛋白（Ras family protein,Ras）,Rab小 GTPase（Rab 18/RabC-family small GTPase,Rab18）,Rab43,真核起始因子（Eukaryotic Initiation Factor,eIF-5A）来研究原癌基因对弓形虫繁殖等功能的影响。运用CRISPR/Cas9技术对上述基因进行缺失后,无虫体存活,从而证明上述原癌基因是弓形虫速殖子生长所必须的基因。在后续试验中,我们对Rab18,Rab43和eIF-5A进行进一步功能研究。此外,我们还对弓形虫组蛋白H3和H4对小鼠巨噬细胞的功能影响进行了分析。本项研究对弓形虫速殖子繁殖机制的阐明具有重要意义,可以为虫体与宿主之间的相互作用研究提供参考。1刚地弓形虫原癌基因缺失株的构建本章研究中,通过定点突变试剂盒将弓形虫TKL,Ras,Rab18,Rab43,eIF-5A和对照基因钙依赖蛋白激酶3（Calcium-dependent protein kinase,CDPK3）的特异性sgRNA替换CRISPR/Cas9载体内的sgRNA,用多片段快速克隆试剂盒构建具有Pyrimethamine抗性片段DHFR的同源重组替换载体。经过PCR和酶切等方法鉴定,所有载体均得到大小正确的目的条带。并通过测序验证,证实载体构建成功。用电转染方法将CRISPR/Cas9载体和DHFR抗性同源替代载体共转染RH株弓形虫速殖子。经1μM Pyrimethamine药物筛选后,提取虫体基因组进行PCR验证,结果发现在CDPK3对照基因的的虫体基因组中获得目的大小一致的条带,且经测序验证,弓形虫CDPK3基因被成功替换。而其他原癌基因均无缺失虫体。独立实验进行五次,均无法获得基因缺失株。因而表明,弓形虫肿瘤原癌基因TKL,Ras,Rab18,Rab43和eIF-5A是虫体生长所必需的基因。2刚地弓形虫eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能及虫体繁殖的影响本章研究中,获得了刚地弓形虫eIF-5A（TgeIF-5A）的重组蛋白,通过重组蛋白与小鼠巨噬细胞的共孵育,分析其对巨噬细胞功能的影响。结果显示eIF-5A蛋白能够促进巨噬细胞的增殖,吞噬和凋亡,并能够促进巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）,白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。但对细胞趋化性和其表面的Toll样受体4（TLR4）表达水平起到抑制作用。我们又选择RNA干扰技术对eIF-5A的功能进行分析,噬斑实验和繁殖实验结果表明在体外条件下,eIF-5A能够调控弓形虫的繁殖过程。粘附实验和侵入实验进一步表明eIF-5A能够减少弓形虫对宿主细胞的粘附,降低侵入细胞的速度。最后通过小鼠毒力实验,表明虫体eIF-5A被干扰后,小鼠的存活时间被延长,弓形虫的毒力明显降低。综上所述,eIF-5A在体外条件下可以影响巨噬细胞的功能,并参与弓形虫侵入宿主细胞和繁殖过程。3刚地弓形虫eIF-5A对虫体蛋白组的影响本章实验的目的是鉴定刚地弓形虫eIF-5A基因所调控的基因的表达情况。将eIF-5A特异性siRNA电转染RH株弓形虫速殖子,孵育24小时后,收集虫体,提取虫体蛋白。用同重同位素相对与绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,ITRAQ）技术进行蛋白组分析。结果显示,一共有1391条肽段和581个蛋白被鉴定到。将鉴定到的581个蛋白进行表达量差异分析,eIF-5A干扰后,共有359个蛋白表达量发生改变,其中表达量下调的有223个,上调的有136个。通过对结果的分析发现,eIF-5A能够调控多种基因的表达,参与调控重要的信号通路过程。并且在表达量下调的蛋白中包括与弓形虫体侵入和毒力相关的微线体（Microneme）,棒状体（Rhoptry）和致密颗粒（Dense granule）,三个特殊的分泌细胞器分泌的多种蛋白。因而,可以进一步的解释前期实验结论,eIF-5A是弓形虫的必需基因,参与到虫体的侵入与繁殖过程。4刚地弓形虫Rab43对虫体繁殖能力的影响由于Rab43在弓形虫生长繁殖过程中是必需的。为了继续研究Rab43的功能,我们设计合成Rab43特异性小干扰RNA（siRNA）干扰虫体Rab43基因。结果发现,Rab43被干扰之后,弓形虫体对细胞的粘附性和侵入能力均明显下降。噬斑实验表明,Rab43被干扰后,噬斑形成变慢,虫体繁殖速度变慢。对纳虫泡内速殖子个数进行计数,结果发现Rab43干扰后的虫体形成的纳虫泡内含1个速殖子的个数明显高于对照组。最后通过小鼠毒力实验证实Rab43被干扰后,小鼠的存活时间明显延长。综上所述,Rab43是弓形虫的必需基因,在体内和体外条件下,均对弓形虫的繁殖起到重要的作用。5刚地弓形虫CDPK3对虫体繁殖能力的影响本章研究中,对前期试验中获得的CDPK3基因缺失株进行进一步验证。并用体内和体外的方法研究CDPK3对弓形虫体繁殖功能的影响。通过噬斑实验和对含1,2,4,8,16个速殖子的纳虫空泡进行统计,发现在体外条件下CDPK3基因缺失对弓形虫的繁殖作用影响不大。继而我们又通过小鼠体内实验分析CDPK3的作用,结果发现,CDPK3缺失后感染小鼠,能够延长小鼠的存活时间。粘附实验和侵入实验结果表明,CDPK3缺失后,虫体粘附和侵入宿主细胞的能力降低。综上所述,CDPK3缺失能够通过对粘附和侵入的影响,减缓弓形虫的繁殖。6刚地弓形虫Rab18的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用本章试验通过将重组弓形虫Rabl8（TgRab18）蛋白与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育,探究其对巨噬细胞功能的影响。采用免疫荧光技术验证rTgRab18在体外环境下与Ana-1细胞的结合情况。利用流式细胞仪检测rTgRab18对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgRab18可以与小鼠巨噬细胞发生结合,从而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达水平。另外实验结果表明,rTgRab 18可以显着促进巨噬细胞的凋亡与吞噬能力。rTgRab 18与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌TNF-α,IL-6和NO水平明显上调。以上结果显示,弓形虫组蛋白Rab18在体外条件下影响小鼠巨噬细胞的功能。7刚地弓形虫H3的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用通过构建弓形虫组蛋白3（H3）原核表达质粒pET-32a（+）-TgH3,经IPTG诱导和镍柱纯化获得rTgH3蛋白。对TgH3序列进行分析显示其高度保守。Western blotting结果显示抗TgH3多克隆抗体和人工感染的抗弓形虫血清能分别识别弓形虫全部可溶性抗原和rTgH3蛋白。免疫荧光实验结果显示TgH3可以结合到小鼠巨噬细胞表面。与rTgH3共孵育后,,巨噬细胞的TLR4表达水平降低。此外,巨噬细胞的趋化性和增殖作用被抑制。然而rTgH3能够增强巨噬细胞的吞噬能力,促进细胞的凋亡及细胞分泌NO、IL-6和TNF-α。综上所述,rTgH3在体外条件下能够调节小鼠巨噬细胞的功能。8刚地弓形虫H4的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用在本部分研究中,通过将重组弓形虫组蛋白H4（TgH4）与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共孵育后,观察巨噬细胞免疫功能的改变。将重组TgH4与Ana-1细胞共孵育,用免疫荧光技术检测rTgH4与Ana-1细胞的结合情况。用流式细胞术检测rTgH4对Ana-1细胞凋亡、吞噬、TLR4分子表达水平和细胞因子分泌的影响。结果显示,rTgH4能够与小鼠巨噬细胞结合,进而抑制巨噬细胞的增殖、趋化性和细胞表面受体TLR4分子的表达。但rTgH4对巨噬细胞的凋亡和吞噬作用起到明显的促进作用。rTgH4与巨噬细胞共孵育后,细胞分泌细胞因子TNF-α,IL-6和NO的水平明显上调。上述结果显示,弓形虫组蛋白H4在体外条件下可以调节小鼠巨噬细胞的功能。
汤新明[9]（2018）在《表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究》文中指出疫苗免疫是动物疫病防控最主要策略之一。在动物疫病疫苗研制中,抗原运送载体在抗原发掘以及提升疫苗安全性和有效性中具有重要作用。随着艾美耳属球虫反向遗传操作平台及其激发宿主免疫应答检测系统的建立与不断完善,转基因艾美耳属球虫作为疫苗载体具备了可行性。本研究从抗原因素（主要是抗原的空间位置、表达量、持续时间/方式）和宿主因素（免疫受体-配体和细胞因子）进行优化,进而提升表达异源抗原的转基因球虫激发的免疫保护力,从而为推进艾美耳属球虫作为疫苗载体提供数据支撑。为了研究病原抗原的表达量对转基因球虫激发宿主免疫应答的影响,本研究以增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和禽流感病毒M2e抗原为模型,通过调控异源抗原表达的不同元件、P2A介导的单表达框共表达多抗原以及异源抗原多拷贝串联表达等多种策略增强转基因球虫表达异源抗原的量。结果显示,SAG13强启动子显着增强EYFP的表达水平;艾美耳属球虫可高效利用P2A的自我剪切功能实现多异源蛋白的共表达;多拷贝串联的M2e的表达水平显着高于单拷贝表达。进一步地,提升转基因球虫表达异源抗原（EYFP或M2e）的量,其激发宿主产生特异性免疫应答的水平显着提升。结果表明,转基因球虫表达异源抗原的量是其激发高水平免疫应答的关键因素之一。为了研究宿主因素对转基因球虫激发宿主免疫应答的影响,本研究将细胞因子或免疫受体的配体表达于转基因球虫,通过细胞因子或免疫受体的配体作为分子佐剂增强球虫免疫原性反映宿主因素对球虫抗原递呈的影响。结果显示,表达鸡白细胞介素2的转基因球虫（EmiChIL-2）激发宿主更强的细胞免疫应答,体液免疫无显着提升。同样,表达巨型艾美耳球虫Profilin的转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-EmPro）的免疫原性显着增强,并且Et-EmPro免疫后芽孢杆菌在鸡群肠道菌群的比例显着提升。表达分子佐剂的转基因球虫（EmiChIL-2和Et-EmPro）免疫鸡群后都表现出更强的抵抗野生型球虫感染的保护力。结果提示,细胞因子和免疫受体的配体等宿主因素可显着影响宿主的免疫应答,是介导球虫抗原有效递呈的关键因子。为了研究表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主产生的保护性免疫应答,本研究将弓形虫的膜抗原1（TgSAG1）和巨型艾美耳球虫的免疫优势抗原IMP1（Immune mapped protein 1,EmIMP1）和AMA1（Apical membrane antigen 1,EmAMA1）分别表达于柔嫩艾美耳球虫。结果显示,表达TgSAG1的转基因球虫不仅能够激发鸡群产生TgSAG1特异性的免疫应答,保护免疫鸡群抵抗部分弓形虫的感染。而且,表达TgSAG1的转基因球虫子孢子免疫小鼠后,激发小鼠产生Th-1型免疫应答,提供抵抗弓形虫感染的部分免疫保护力,延长小鼠存活时间。表达EmIMP1的转基因柔嫩艾美耳球虫免疫后,可保护鸡群抵抗巨型艾美耳球虫的感染,并且免疫保护力随着表达免疫优势抗原虫种的增加,即表达EmMP1和表达EmAMA1的转基因柔嫩艾美耳球虫共同免疫后,保护力得到加强。结果说明,球虫作为疫苗载体可有效运送和递呈异源病原的免疫优势抗原至宿主免疫系统,启动保护性免疫应答。综上,优化病原因素可显着提升转基因球虫表达异源抗原特异性的免疫应答,优化宿主因素可显着提升球虫抗原特异性的免疫应答,为研发安全有效的新型球虫病疫苗虫株和球虫载体亲本虫株奠定基础。球虫作为疫苗载体表达的异源病原优势抗原可被宿主免疫系统识别,产生良好免疫保护力。从实践证实转基因球虫作为疫苗载体具有可行性。
李木子[10]（2017）在《弓形虫半胱氨酸蛋白酶Metacaspases功能及作用机制》文中研究说明龚地弓形虫（Toxoplasma gondii,简称弓形虫）寄生于温血动物和人的有核细胞,是重要的人兽共患病原。在对弓形虫体内及体外研究中均观察到速殖子的凋亡现象,但引发弓形虫凋亡的相关因子和机制尚未见报道。大量研究显示,一类以组氨酸和半胱氨酸为催化位点的半胱氨酸水解酶-Metacaspases在植物、真菌及原虫中具有参与凋亡、调控细胞周期和降解错误折叠蛋白等重要功能。我们利用数据库搜索比对发现弓形虫中存在三个Metacaspases（MCAs）,分别命名为TgMCA1、TgMCA2和TgMCA3,三者的功能均未见报道。生物信息学分析发现,MCA1与酿酒酵母同源蛋白YCA1相似性达49%,且具有组氨酸和半胱氨酸组成催化活性位点;MCA2的半胱氨酸相邻的组氨酸和MCA3的组氨酸均有突变。我的博士论文对MCA1和MCA2进行较为系统的研究。我们首先观察了 MCA1的表达和定位,发现弓形虫速殖子能够表达MCA1,其定位于胞内虫体的胞质中;当虫体释放至胞外,MCA1由胞质向胞核转移并最终聚集于虫体胞核;当弓形虫发生分裂时,MCA1定位于子代虫体的内膜复合体。为了进一步研究MCA1的功能,我们利用基因编辑技术构建了弓形虫MCA1基因缺失株（△mca1）和过表达株（mca1-OE）。对不同调控虫株进行比较研究发现,体外培养△mca1的增殖能力与母源株Aku80无明显差异;mca1-OE的增殖能力下降,虫体胞质分裂延迟,推测MCA1可能参与调控虫体分裂。对弓形虫的凋亡进行检测发现,Amca1置于胞外缓冲液4 h时虫体凋亡率为20%,显着低于△ku80株（37%）,而mca1-OE凋亡率为54%,证实MCA1参与调节弓形虫凋亡。为了进一步研究弓形虫MCAs的功能,我们对MCA2 展开研究。对构建的TgMCA2内源性标记虫株进行IFA,发现MCA2定位于弓形虫胞质中,未检测到其向虫体胞核转移和与IMC1共定位的情况。利用同源重组技术构建了MCA2基因缺失株（△mca2）及MCA1和MCA2双基因缺失株（△mca1△mca2）。对各基因调控虫株比较研究发现,体外培养的△mca2、△mca1与母源虫株Aku80的分裂增殖无明显差异,而双基因缺失株△mca1Amca2的增殖能力显着下降。经腹腔感染的△ku80、△mca1和Amca2株速殖子的小鼠于感染后6至11天陆续死亡,各虫株对小鼠的致病性差异不显着,感染Amca1△mca2的37%小鼠（9/24）耐过并存活,说明双基因缺失虫株对小鼠的致病性降低。进一步观察细胞培养中各虫株发育和繁殖,发现Amca1和△mca2单一基因缺失时不影响虫体的内二分裂,胞内逸出的速殖子形态正常。双基因缺失株Amca1Amca2的大部分速殖子（61.9%带虫空泡内的速殖子）不能成功分裂出子代虫体,出现多核体现象且子代虫体的内膜复合体表达和定位异常;释放后的大部分虫体在胞外环境变圆,不能保持正常形态。经表面活性剂脱氧胆酸盐提取全虫蛋白,发现双基因缺失虫株△mca1 Amca2的内膜复合体蛋白IMC1比Aku80虫株更易溶解于脱氧胆酸盐中,提示双基因缺失株IMC1的成熟受到抑制,证实弓形虫MCA1和MCA2共同参与虫体IMC1的加工成熟。综上所述,MCA1和MCA2在虫体的生命活动中具有重要功能。MCA1参与弓形虫自身凋亡,其在虫体内的定位随着虫体生命活动发生变化;两种蛋白在虫体分裂过程中共同发挥作用,参与弓形虫二分裂过程中内膜复合体蛋白IMC1的形成;而虫体单一缺失MCA1或MCA2时对子代虫体分裂的影响不显着。
二、弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达（论文提纲范文）
（1）羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巴贝斯虫 |
| 1.1.1 我国羊巴贝斯虫的分离与鉴定 |
| 1.1.2 我国羊巴贝斯虫的分布情况 |
| 1.1.3 巴贝斯虫的体外培养 |
| 1.1.4 顶复门原虫基因功能研究技术现状 |
| 1.2 顶质体研究进展 |
| 1.2.1 顶质体的发现与起源 |
| 1.2.2 顶质体的基因组 |
| 1.2.3 顶质体的生物学功能 |
| 1.2.3.1 顶质体II型脂肪酸生物合成 |
| 1.2.3.2 顶质体铁硫簇生物合成 |
| 1.2.3.3 顶质体血红素生物合成 |
| 1.2.3.4 顶质体类异戊二烯生物合成 |
| 1.3 自噬 |
| 1.3.1 经典自噬途径 |
| 1.3.2 疟原虫及弓形虫自噬的研究现状 |
| 1.3.3 感染疟原虫或弓形虫宿主细胞自噬研究现状 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 梨形虫ATG生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 梨形虫ATG基因的生物信息学分析及扩增 |
| 2.2.2 梨形虫ATG序列比对及相似性分析 |
| 2.2.3 遗传进化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 梨形虫ATG基因的分布 |
| 2.3.2 梨形虫ATG氨基酸序列比对分析 |
| 2.3.3 基于顶复门原虫ATG氨基酸序列构建的遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 羊巴贝斯虫顶质体与线粒体基因组序列测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 顶质体和线粒体基因组的扩增与测序 |
| 3.2.3 顶质体和线粒体基因组的拼接与注释 |
| 3.2.4 cytb基因序列比对 |
| 3.2.5 系统发育分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 顶质体和线粒体基因组序列分析 |
| 3.3.2 羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组与其他顶复门原虫比对分析 |
| 3.3.3 Sanger与Illumina方法测序的顶质体和线粒体基因组比对分析 |
| 3.3.4 cytb基因序列分析 |
| 3.3.5 系统进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 顶质体基因组 |
| 3.4.2 线粒体基因组 |
| 第四章 羊巴贝斯虫未定种新疆株瞬时和稳定转染体系的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 羊巴贝斯虫未定种新疆株体外培养 |
| 4.2.2 评估BSD对羊巴贝斯虫未定种新疆株抑制效果 |
| 4.2.3 质粒的构建 |
| 4.2.4 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.2.5 BspXJ稳定转染虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.3.2 BspXJ稳定转染虫株的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BspXJ瞬时转染 |
| 4.4.2 BspXJ稳定转染 |
| 第五章 ATG蛋白亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 BspXJ的ATG、顶质体Marker分子基因的扩增 |
| 5.2.2 ATG和顶质体Marker分子基因分析 |
| 5.2.3 原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 蛋白诱导表达及纯化 |
| 5.2.5 抗体的制备及鉴定 |
| 5.2.6 ATG3与ATG8过表达质粒的构建 |
| 5.2.7 ATG3与ATG8过表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 5.2.8 ATG3与ATG8亚细胞定位 |
| 5.2.9 ATG3和ATG8互作蛋白的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目的基因分析 |
| 5.3.2 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 5.3.3 抗体纯化及鉴定 |
| 5.3.4 ATG3过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.5 ATG8过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.6 ATG3和ATG8在BspXJ中的亚细胞定位 |
| 5.3.7 ATG3与ATG8相互作用蛋白鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 自噬抑制剂和诱导剂对羊巴贝斯虫ATG表达丰度的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 实验材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 筛选BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.2.2 qPCR检测HBSS饥饿诱导BspXJ后ATG基因表达丰度 |
| 6.2.3 自噬抑制剂和诱导剂处理BspXJ后ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.3.2 饥饿诱导对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3.3 自噬抑制剂和诱导剂对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 羊巴贝斯虫ATG基因敲除虫株的构建及条件性基因敲除平台的建立 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 主要仪器 |
| 7.1.2 实验材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 ATG基因敲除虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.2 TIR1表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.3 IAA对BspXJ虫株生长的影响 |
| 7.2.4 mCherry-AID-3HA表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 ATG3和ATG8 基因敲除虫株的筛选及鉴定 |
| 7.3.2 TIR1-3Flag表达虫株的PCR、WB及 IFA鉴定结果 |
| 7.3.3 IAA对BspXJ形态及染虫率的影响 |
| 7.3.4 m Cherry-AID-3HA虫株WB及IFA鉴定 |
| 7.3.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A ATGs氨基酸比对结果 |
| 附录B 顶质体基因组扩增引物、线粒体基因组比对图和顶质体基因组图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）弓形虫UTPG基因的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病 |
| 1.2 弓形虫的基因型分类 |
| 1.3 弓形虫中存在的糖基化修饰途径 |
| 1.3.1 弓形虫的N-糖基化修饰 |
| 1.3.2 弓形虫SKP1 蛋白的糖基化修饰 |
| 1.3.3 弓形虫的GPI锚定修饰 |
| 1.3.4 弓形虫的O-糖基化修饰 |
| 1.3.5 弓形虫的核质蛋白糖基化修饰 |
| 1.4 弓形虫中的糖核苷酸的合成 |
| 1.5 UDP-N-乙酰葡萄糖胺 |
| 1.6 CRISPR/CAS9基因编辑技术 |
| 1.7 TIR1-AID生长素调控系统 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株、虫株与细胞 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂盒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 弓形虫的体外培养 |
| 3.3.2 弓形虫基因组DNA的粗提取 |
| 3.3.3 弓形虫RNA的提取 |
| 3.3.4 弓形虫c DNA的制备 |
| 3.3.5 相关质粒的构建 |
| 3.3.6 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.7 His融合蛋白的纯化 |
| 3.3.8 纯化蛋白的透析与保存 |
| 3.3.9 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 3.3.10 基因敲除虫株的构建与鉴定 |
| 3.3.11 复制实验 |
| 3.3.12 入侵实验 |
| 3.3.13 空斑实验 |
| 3.3.14 Western-blot鉴定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 弓形虫中UDP-N-乙酰焦磷酸化酶的生物信息学分析 |
| 4.2 UTPG基因条件性敲除虫株的构建及表型研究 |
| 4.2.1 UTPG基因条件性敲除虫株质粒的构建 |
| 4.2.2 UTPG基因条件性敲除虫株电转及鉴定 |
| 4.2.3 UTPG基因的缺失对弓形虫是致死的 |
| 4.3 UTPG基因回补虫株的构建及表型研究 |
| 4.3.1 UTPG基因回补虫株的质粒构建 |
| 4.3.2 UTPG基因回补虫株的电转及鉴定 |
| 4.3.3 UTPG 基因回补虫株可以成功回补UTPG 基因缺失的表型 |
| 4.4 UTPG基因点突变虫株的构建及表型研究 |
| 4.4.1 UTPG基因点突变虫株质粒构建 |
| 4.4.2 UTPG基因点突变虫株虫株鉴定 |
| 4.4.3 G330位点对于UTPG基因至关重要 |
| 4.5 异源回补COMP-SCUAP1虫株的构建 |
| 4.5.1 异源回补Comp-SCUAP1虫株质粒构建 |
| 4.5.2 异源回补Comp-SCUAP1 虫株虫株鉴定 |
| 4.5.3 异源回补酵母UAP1 基因能回补UTPG基因缺失造成的表型缺陷 |
| 4.6 UTPG(900AA)蛋白的表达与纯化 |
| 4.6.1 UTPG(900aa)原核表达质粒的构建 |
| 4.6.2 UTPG(900aa)蛋白的原核表达 |
| 4.6.3 UTPG(900aa)蛋白的纯化 |
| 5 讨论 |
| 5.1 弓形虫UTPG的功能研究 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）AP2X-4和AP2XⅡ-5对弓形虫生长发育的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 弓形虫和弓形虫病概述 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的致病机制 |
| 1.2 弓形虫缓殖子的形成 |
| 1.2.1 体外速殖子与缓殖子的转化 |
| 1.2.2 缓殖子分化发育研究进展 |
| 1.3 ApiAP2转录因子研究进展 |
| 1.3.1 Api AP2 转录因子结果及DNA结合序列 |
| 1.3.2 弓形虫ApiAP2转录因子研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 实验材料与方法 |
| 3.1 .实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 |
| 3.1.3 载体与质粒 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 .主要仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂盒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配置 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 弓形虫的体外培养 |
| 3.3.2 弓形虫基因组DNA的提取 |
| 3.3.3 弓形虫RNA的提取 |
| 3.3.4 弓形虫cDNA的制备 |
| 3.3.5 相关质粒的构建 |
| 3.3.6 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.7 GST融合蛋白的纯化 |
| 3.3.8 His融合蛋白的纯化 |
| 3.3.9 包涵体重组蛋白的大量提取与纯化 |
| 3.3.10 纯化蛋白的透析与保存 |
| 3.3.11 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 3.3.12 AP2XⅡ-5与p LDH2 的结合 |
| 3.3.13 动物免疫实验 |
| 3.3.14 基因敲除虫株的构建与鉴定 |
| 3.3.15 复制实验 |
| 3.3.16 入侵实验 |
| 3.3.17 逸出实验 |
| 3.3.18 空斑实验 |
| 3.3.19 缓殖子转化率实验 |
| 3.3.20 缓殖子复制实验 |
| 3.3.21 弓形虫虫株毒力实验 |
| 3.3.22 ELISA测小鼠血清 |
| 3.3.23 脑包囊计数 |
| 3.3.24 定量RT-PCR检测基因表达差异 |
| 3.3.25 Western-blot鉴定 |
| 3.3.26 RNA样品收集 |
| 3.3.27 总RNA的提取及高通量测序 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 定量RT-PCR验证AP2X-4和AP2XⅡ-5 在速殖子与缓殖子中的表达差异.. |
| 4.2 AP2XⅡ-5转录因子的功能研究 |
| 4.2.1 .AP2XⅡ-5缺失虫株的验证 |
| 4.2.2 .AP2XⅡ-5对缓殖子复制的影响 |
| 4.2.3 .AP2XⅡ-5对虫株毒力的影响 |
| 4.2.4 .AP2XⅡ-5对基因表达的调控作用 |
| 4.2.5 .AP2XⅡ-5与LDH2 启动子的特异性结合 |
| 4.3 AP2X-4转录因子的功能研究 |
| 4.3.1 AP2X-4蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 4.3.2 AP2X-4基因的敲除 |
| 4.3.3 .AP2X-4对弓形虫生长非常重要 |
| 4.3.4 .条件性蛋白降解技术验证AP2X-4的功能 |
| 4.3.5 .AP2X-4影响弓形虫对宿主细胞的入侵 |
| 4.3.6 .AP2X-4影响弓形虫的毒力 |
| 4.3.7 .AP2X-4对棒状体蛋白表达的调控作用 |
| 5 讨论 |
| 5.1 弓形虫AP2XⅡ-5的功能 |
| 5.2 弓形虫AP2X-4的功能 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）细粒棘球绦虫原头蚴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 细粒棘球绦虫原头蚴囊化过程的不同发育 时期转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 蛋白激酶A基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 蛋白激酶A真核表达及免疫反应性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（5）弓形虫致密颗粒和棒状体分泌蛋白的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 弓形虫和弓形虫病 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的宿主范围和流行病学 |
| 1.2 弓形虫分泌蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 弓形虫的分泌蛋白类型 |
| 1.2.2 弓形虫完成胞内生长周期需要分泌蛋白的协助 |
| 1.2.3 弓形虫依赖分泌蛋白介导与宿主的互作 |
| 1.3 蛋白标记技术研究进展 |
| 1.3.1 生物素——亲和素系统 |
| 1.3.2 生物素标记技术及其应用 |
| 1.3.3 其它标记技术 |
| 1.4 蛋白质相互作用技术的研究进展 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.4.3 Pull-down技术 |
| 1.4.4 其它方法 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 新型致密颗粒蛋白的筛选、鉴定和功能研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 虫株、菌株和细胞 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器与试剂 |
| 2.1.6 主要溶液及配制 |
| 2.1.7 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 生物素标记质粒的构建 |
| 2.2.2 生物素标记虫株的构建 |
| 2.2.3 融合蛋白GRA1-APEX/BirA*的表达检测 |
| 2.2.4 生物素标记蛋白的检测 |
| 2.2.5 标记蛋白的富集纯化 |
| 2.2.6 蛋白质谱分析 |
| 2.2.7 新型致密颗粒蛋白的鉴定 |
| 2.2.8 候选蛋白的定位分析 |
| 2.2.9 致密颗粒蛋白的功能研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 诱饵蛋白的选取、表达和比较 |
| 2.3.2 质谱数据的处理 |
| 2.3.3 候选致密颗粒蛋白的分析 |
| 2.3.4 依赖APEX和 BirA*催化的生物素标记技术在弓形虫的应用 |
| 2.3.5 APEX和 BirA*两方法的比较 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 与棒状体蛋白ROP16 互作宿主蛋白的筛选和鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和细胞 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 主要仪器与试剂 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 酵母双杂交诱饵质粒的构建 |
| 3.2.2 诱饵质粒的自激活和毒性 |
| 3.2.3 诱饵蛋白的表达检测 |
| 3.2.4 互作宿主蛋白的筛选 |
| 3.2.5 互作结构域的确定 |
| 3.2.6 相互作用的验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 酵母双杂交系统的选择 |
| 3.3.2 与ROP16 互作蛋白的筛选 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）弓形虫重组蛋白SAG1纳米金生物传感器诊断弓形虫病的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌种与血清 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要试剂的配制 |
| 2.5 方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 目的基因tSAG1 的克隆与鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒pET-28a(+)-tSAG1 的构建 |
| 3.3 tSAG1 的表达、纯化与鉴定 |
| 3.4 金纳米棒生物传感器的构建 |
| 3.5 金纳米棒生物传感器的血清学检测 |
| 3.6 金纳米簇模拟酶可视化生物传感器的构建 |
| 3.7 金纳米簇模拟酶可视化生物传感器的血清学检测 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 ：中英文缩略词表 |
| 附录2 ：在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）弓形虫酰基辅酶A结合蛋白功能及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.2.1 解析弓形虫ACBP的表达、定位和蛋白活力 |
| 1.2.2 构建ACBP基因调控虫株 |
| 1.2.3 揭示ACBP的功能及作用机制 |
| 1.3 研究目标 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 顶复亚门原虫的脂类代谢 |
| 2.1.1 FAS Ⅰ途径 |
| 2.1.2 FAS Ⅱ途径 |
| 2.1.3 FAE途径 |
| 2.1.4 磷脂代谢 |
| 2.1.5 脂类补救途径 |
| 2.2 脂类代谢与其他代谢的关系 |
| 2.3 长链酰基辅酶A代谢 |
| 2.4 酰基辅酶A结合蛋白 |
| 2.4.1 酰基辅酶A结合蛋白的结构特点 |
| 2.4.2 酰基辅酶A结合蛋白的研究进展 |
| 第三章 弓形虫ACBPs的生物信息学分析与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 TgACBP1和TgACBP2的生物信息分析 |
| 3.2.2 TgACBP1和TgACBP2的克隆、表达与鉴定 |
| 3.2.3 TgACBP1和TgACBP2内源性标记虫株 |
| 3.2.4 TgACBP1和TgACBP2的蛋白活力分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 TgACBP1功能及其作用机制 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TgACBP1基因调控虫株的构建及鉴定 |
| 4.2.2 TgACBP1基因调控虫株的表型 |
| 4.2.3 TgACBP1对虫体甘油三酯含量的影响 |
| 4.2.4 TgACBP1对虫体摄取宿主细胞脂肪酸能力的影响 |
| 4.2.5 TgSCP2的表达、定位和蛋白活力 |
| 4.2.6 TgSCP2基因调控虫株的构建及鉴定 |
| 4.2.7 TgSCP2基因调控虫株的表型 |
| 4.2.8 TgACBP1与TgSCP2基因调控虫株脂肪酸含量的变化 |
| 4.2.9 TgACBP1与TgSCP2基因修饰虫株脂肪酸合成代谢的变化 |
| 4.2.10 TgACBP1和TgSCP2基因双缺失对虫体甘油酯代谢的影响 |
| 4.2.11 TgACBP1和TgSCP2基因双缺失对虫体磷脂代谢的影响 |
| 4.2.12 TgACBP1和TgSCP2基因调控虫株对小鼠的致病性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 TgACBP2功能及其作用机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TgACBP2在胞内和胞外虫体的表达与定位 |
| 5.2.2 [K~+]与[Ca~(2+)]介导TgACBP2的去磷酸化 |
| 5.2.3 ACBP2基因修饰虫株的构建及鉴定 |
| 5.2.4 ACBP2基因修饰虫株的表型变化 |
| 5.2.5 ACBP2不同结构域对Pru虫体生长的影响 |
| 5.2.6 ACBP2参与维持线粒体功能 |
| 5.2.7 ACBP2参与Pru虫株心磷脂合成 |
| 5.2.8 线粒体募集相关因子MAF1RHb1对Pru△ACBP2表型的影响 |
| 5.2.9 MAF1RHb1的表达对Pru△ACBP2虫株脂类代谢的影响 |
| 5.2.10 TgACBP2基因修饰虫株对小鼠的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫与弓形虫病 |
| 1 弓形虫的发现 |
| 2 弓形虫的生活史 |
| 3 弓形虫繁殖 |
| 3.1 细胞周期进程 |
| 3.2 作为组织中心的中心体 |
| 3.3 有丝分裂 |
| 4 弓形虫病 |
| 4.1 人弓形虫病 |
| 4.2 动物弓形虫病 |
| 5 弓形虫的诊断 |
| 5.1 直接检查法 |
| 5.2 免疫学诊断法 |
| 5.3 分子诊断法 |
| 6 弓形虫病的治疗 |
| 7 弓形虫的预防 |
| 参考文献 |
| 第二章 原癌基因 |
| 1 原癌基因分类 |
| 1.1 逆转录病毒致癌基因 |
| 1.2 从基因转移实验中发现的细胞癌基因 |
| 1.3 潜在的癌基因 |
| 2 原癌基因在正常细胞中的功能 |
| 2.1 编码生长因子的原癌基因 |
| 2.2 生长因子受体原癌基因 |
| 2.3 细胞外信号的传导器 |
| 2.4 核转录因子 |
| 3 部分原癌基因与癌症的关系 |
| 3.1 Ras家族基因与癌症 |
| 3.2 蛋白酪氨酸激酶与癌症 |
| 3.3 新癌基因与癌症 |
| 4 寄生原虫原癌基因的研究 |
| 参考文献 |
| 第三章 弓形虫组蛋白研究进展 |
| 1 弓形虫的组蛋白概况 |
| 2 弓形虫组蛋白修饰 |
| 2.1 H4 |
| 2.2 H3 |
| 2.3 H2A和H2B |
| 3 弓形虫分化过程中组蛋白修饰的初步模型 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 刚地弓形虫原癌基因缺失株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 刚地弓形虫eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能及虫体繁殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 eIF-5A的克隆表达 |
| 2.2 eIF-5A western blot分析 |
| 2.3 eIF-5A对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 2.4 eIF-5A的RNA干扰 |
| 2.5 噬斑实验 |
| 2.6 粘附实验 |
| 2.7 侵入实验 |
| 2.8 细胞内增殖实验 |
| 2.9 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 刚地弓形虫eIF-5A对虫体蛋白组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白质鉴定 |
| 2.2 蛋白定量重复性分析 |
| 2.3 蛋白质iTRAQ定量 |
| 2.4 蛋白GO注释分析 |
| 2.5 蛋白COG注释分析 |
| 2.6 蛋白Pathway注释分析 |
| 2.7 差异蛋白GO富集分析 |
| 2.8 差异蛋白Pathway富集分析 |
| 2.9 差异蛋白分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 刚地弓形虫Rab43对虫体繁殖能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Rab43的克隆表达 |
| 2.2 Rab43 western blot分析 |
| 2.3 Rab43的RNA干扰 |
| 2.4 噬斑实验 |
| 2.5 粘附实验 |
| 2.6 侵入实验 |
| 2.7 细胞内增殖实验 |
| 2.8 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 刚地弓形虫CDPK3对虫体繁殖能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CDPK3缺失株的构建 |
| 2.2 噬斑实验 |
| 2.3 粘附实验 |
| 2.4 侵入实验 |
| 2.5 细胞内增殖实验 |
| 2.6 小鼠毒力实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 刚地弓形虫Rab18的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 Rab18序列的PCR扩增 |
| 2.3 弓形虫Rab18原核表达载体的构建 |
| 2.4 弓形虫Rab18重组蛋白的表达 |
| 2.5 rTgRab18的抗原性分析 |
| 2.6 rTgRab18蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.7 Ana-1细胞增殖实验 |
| 2.8 Ana-1细胞凋亡实验 |
| 2.9 Ana-1细胞吞噬实验 |
| 2.10 Ana-1细胞趋化性实验 |
| 2.11 Ana-1细胞Toll样受体4检测 |
| 2.12 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.13 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十章 刚地弓形虫H3的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 基因的PCR扩增 |
| 2.3 pET-32a(+)表达载体的构建 |
| 2.4 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 抗原性分析 |
| 2.6 Western blot分析 |
| 2.7 rTgH3蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.8 细胞增殖实验 |
| 2.9 细胞凋亡实验 |
| 2.10 细胞吞噬实验 |
| 2.11 细胞趋化性实验 |
| 2.12 细胞Toll样受体4检测 |
| 2.13 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.14 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十一章 刚地弓形虫H4的克隆表达及其对小鼠巨噬细胞功能的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 H4序列的PCR扩增 |
| 2.3 弓形虫H4原核表达载体的构建 |
| 2.4 弓形虫H4重组蛋白的表达 |
| 2.5 TgH4的抗原性分析 |
| 2.6 rTgH4蛋白与Ana-1细胞结合实验 |
| 2.7 Ana-1细胞增殖实验 |
| 2.8 Ana-1细胞凋亡实验 |
| 2.9 Ana-1细胞吞噬实验 |
| 2.10 Ana-1细胞趋化性实验 |
| 2.11 Ana-1细胞Toll样受体4检测 |
| 2.12 Ana-1细胞因子分泌实验 |
| 2.13 Ana-1细胞NO分泌实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 附录 |
（9）表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 研究背景及科学问题的提出 |
| 1.1 艾美耳属球虫反向遗传操作平台的建立 |
| 1.2 艾美耳属球虫作为疫苗载体的研究进展 |
| 1.3 拟解决的科学问题 |
| 2 研究目的和意义 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 4 研究目标 |
| 第二章 转基因球虫表达异源抗原的量对免疫应答的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 虫株与实验动物 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂与相关溶液配制 |
| 2.4 转染载体构建 |
| 2.5 转基因球虫的构建、筛选与鉴定 |
| 2.6 转基因球虫表达异源蛋白水平的检测 |
| 2.7 转基因球虫表达不同水平异源抗原激发宿主免疫应答的检测 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 提升转基因球虫表达模式抗原水平策略的探索 |
| 3.2 不同启动子调控黄色荧光蛋白表达水平差异比较 |
| 3.3 模式抗原M2e不同拷贝数表达水平差异比较 |
| 3.4 转基因球虫高表达异源抗原对免疫应答的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 转基因球虫表达分子佐剂对其免疫原性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 虫株与实验动物 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂与相关溶液配制 |
| 2.4 表达分子佐剂的转染载体的构建 |
| 2.5 表达分子佐剂的转基因球虫的构建、筛选与鉴定 |
| 2.6 表达分子佐剂的转基因球虫激发宿主免疫应答的检测 |
| 2.7 表达分子佐剂的转基因球虫激发宿主免疫保护力的检测 |
| 2.8 转基因球虫免疫后肠道菌群变化的检测 |
| 2.9 数据处理与统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 表达分泌型ChIL-2的转基因球虫的构建与生物学特性研究 |
| 3.2 表达ChIL-2的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究 |
| 3.3 表达Profilin的转基因球虫的构建与生物学特性研究 |
| 3.4 表达Profilin的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究 |
| 3.5 表达Profilin的转基因球虫免疫对鸡群肠道微生态的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主的保护性免疫应答 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 虫株与实验动物 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂与相关溶液配制 |
| 2.4 转染载体构建 |
| 2.5 表达异源抗原的转基因球虫的构建、筛选与鉴定 |
| 2.6 表达异源抗原的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的检测 |
| 2.7 数据处理与统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 表达弓形虫膜表面抗原1的转基因柔嫩艾美耳球虫(Et-TgSAG1)的构建与鉴定 |
| 3.2 Et-TgSAG1激发鸡抵抗弓形虫感染的保护性免疫应答 |
| 3.3 Et-TgSAG1激发小鼠抗弓形虫感染的保护性免疫应答 |
| 3.4 表达EmIMP1的转基因柔嫩艾美耳球虫(Et-EmIMP1)的构建与生物学特性研究 |
| 3.5 Et-EmIMP1激发鸡抗柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫感染的保护性免疫应答 |
| 3.6 Et-EmIMP1与Et-EmAMA1共同免疫提升抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护力 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 第七章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 病毒疫苗载体的研究进展 |
| 2.1 疱疹病毒疫苗载体 |
| 2.2 腺病毒疫苗载体 |
| 2.3 痘病毒疫苗载体 |
| 3 细菌疫苗载体的研究进展 |
| 3.1 沙门氏菌疫苗载体 |
| 3.2 乳酸杆菌疫苗载体 |
| 4 寄生虫疫苗载体的研究进展 |
| 5 提升重组疫苗免疫保护力的策略 |
| 5.1 病原因素 |
| 5.2 宿主因素 |
| 5.3 病原-宿主协同因素 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）弓形虫半胱氨酸蛋白酶Metacaspases功能及作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 研究内容和方法 |
| 1.2.1 解析Metacaspases的表达、定位和酶活性 |
| 1.2.2 构建弓形虫Metacaspases基因调控株 |
| 1.2.3 揭示Metacaspases功能及作用机制 |
| 1.3 研究目标 |
| 1.4 技术路线 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 Metacaspases |
| 2.1.1 Metacaspases结构 |
| 2.1.2 Metacaspases功能 |
| 2.2 弓形虫的内二分裂 |
| 2.2.1 胞核分裂 |
| 2.2.2 胞质分裂 |
| 第三章 弓形虫Metacaspase1和Metacaspase2的分析及表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 生物信息学分析TgMCAs |
| 3.3.2 TgMCA1基因克隆与原核表达 |
| 3.3.3 TgMCA1的内源性表达与定位 |
| 3.3.4 TgMCA1、TgMCA2内源性标记虫株的构建与鉴定 |
| 3.3.5 TgMCA1酶活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 弓形虫Metacaspases基因调控株的构建及鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基因敲除质粒pTCR-CD TgMCA1 KO的构建 |
| 4.3.2 过表达质粒pDXF-TgMCA1和pDXF-TgMCA1 HA的构建 |
| 4.3.3 基因回补质粒pUPRT-TgMCA1的构建 |
| 4.3.4 基因敲除质粒pDHFR-TgMCA2 KO的构建 |
| 4.3.5 TgMCA1基因调控株的构建及鉴定 |
| 4.3.6 TgMCA2基因缺失株(△mca2)的构建及鉴定 |
| 4.3.7 TgMCA1和TgMCA2双基因敲虫株(△mca1△mca2)的构建及鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 弓形虫Metacaspases的功能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 TgMCA1基因调控虫株的表型变化 |
| 5.3.2 TgMCA2缺失虫株及TgMCA1和TgMCA2双敲虫株的表型 |
| 5.3.3 TgMCA1和TgMCA2参与弓形虫分裂繁殖 |
| 5.3.4 TgMCA1和TgMCA2共同参与内膜复合体蛋白的成熟 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达（论文参考文献）
- [1]羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究[D]. 王晓星. 中国农业科学院, 2021
- [2]弓形虫UTPG基因的生物学功能研究[D]. 杨承杭. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]AP2X-4和AP2XⅡ-5对弓形虫生长发育的调节作用[D]. 张晶雯. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]细粒棘球绦虫原头蚴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达[D]. 范俊杰. 重庆医科大学, 2020(12)
- [5]弓形虫致密颗粒和棒状体分泌蛋白的鉴定和功能研究[D]. 潘明. 华中农业大学, 2019
- [6]弓形虫重组蛋白SAG1纳米金生物传感器诊断弓形虫病的研究[D]. 张玉娟. 湖南师范大学, 2019(12)
- [7]弓形虫酰基辅酶A结合蛋白功能及其作用机制[D]. 傅勇. 中国农业大学, 2019(02)
- [8]刚地弓形虫原癌基因eIF-5A，Rab43和Rab18蛋白及组蛋白H3，H4的生物学功能研究[D]. 刘欣超. 南京农业大学, 2018(07)
- [9]表达异源优势抗原的转基因球虫激发宿主保护性免疫应答的研究[D]. 汤新明. 中国农业大学, 2018(12)
- [10]弓形虫半胱氨酸蛋白酶Metacaspases功能及作用机制[D]. 李木子. 中国农业大学, 2017(08)