一、1997～2004年缺氧诱导因子文献统计分析（论文文献综述）
张晓红[1]（2021）在《低氧诱导因子-1α调控心肌细胞自噬和凋亡与急性心肌梗死患者预后的关系及机制研究》文中提出目的:1、急性心肌梗死患者发病前的健康状况、发病时的临床特征、治疗策略和方案以及治疗后的生活方式改变、用药依从性等各种因素,对远期预后会产生不同性质和程度的影响。本研究为前瞻性队列研究,描述和比较观察急性心肌梗死患者基本特征、冠脉病变特征、冠状动脉粥样硬化负担以及患者一年、五年终点事件发生情况及其影响因素,旨在探索新的预后指标,为预测急性心肌梗死患者的预后、指导优化诊疗策略提供客观依据。2、根据第一部分研究发现,探讨急性心肌梗死患者PCI治疗后剩余冠状动脉粥样硬化负担对远期预后的影响及临床意义。针对动脉粥样硬化负担导致冠心病患者持续存在不同程度的心肌缺氧状态,以剩余Gensini评分量化动脉粥样硬化负担反映心肌缺氧程度,探索持续存在的不同程度心肌缺氧对远期预后的影响。3、缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α）是细胞适应缺氧的主要转录因子和核心调控器,参与调控能量供给、自噬、凋亡以及其他缺氧适应性反应,对器官组织结构、功能和代谢产生短期和长期的影响。根据前两部分的研究结果,针对AMI患者PCI治疗后心肌细胞仍存在不同程度缺氧,探索急性心肌梗死患者血清中HIF-1α、自噬相关蛋白Beclin-1以及凋亡相关蛋白Bcl-2水平与急性心肌梗死患者远期预后的关系和临床意义。4、通过H9C2大鼠心肌细胞实验,模拟不同临床状态,探索不同缺氧状态下HIF-1α调节心肌细胞自噬与凋亡的内在机制。研究方法:1、第一部分为急性心肌梗死患者的前瞻性队列研究,以及一年及五年的随访结果及预后研究。连续入选2012年12月至2014年6月急性心肌梗死患者。研究通过伦理委员会同意,入选患者均签署知情同意书。完成基线入组,收集记录人口资料、既往状况、临床特征、实验室指标以及治疗情况。全部病例均接受PCI治疗,出院后进行1个月、1年及5年随访,包括生活状况、生活方式改变、运动情况、用药情况、用药依从性及MACE事件（全因死亡、非致死性心肌梗死、非计划性冠脉血运重建、心力衰竭、心绞痛以及脑卒中等）。通过单变量分析,利用Kaplan-Meier法描绘生存曲线,Log-rank检验比较生存曲线是否存在差异。采用单因素Cox回归分析,根据α=0.10的水准筛选出潜在预后影响因素,筛选出的全部因素纳入Cox回归模型,进行多因素分析。统计学检验水准规定在α=0.05水平。所有统计分析均采用IBM SPSS 25.0统计软件进行分析。2、根据第一部分研究发现,rGS可以量化剩余冠状动脉粥样硬化负担,是急性心肌梗死PCI治疗后五年MACE的独立预测因子。第二部分以rGS中位数分组,比较高、低rGS两组之间基线特征、死亡率以及MACE发生率。利用Kaplan-Meier法描绘生存曲线,Log-rank检验比较一年和五年的死亡与MACE之间的差异。采用单因素Cox回归分析,根据α=0.10的水准筛选出潜在预后影响因素,筛选出的全部因素纳入Cox回归模型,进行多因素分析。统计学检验水准规定在α=0.05水平。所有统计分析均采用IBM SPSS 25.0统计软件进行分析。3、应用ELISA方法检测入组患者血清中HIF-1α、自噬相关蛋白Beclin-1以及凋亡相关蛋白Bcl-2水平。将HIF-1α、Beclin-1以及Bcl-2作为生物标记物,中位数水平分为高、低浓度组。比较高、低浓度组之间基线特征、死亡率以及MACE发生率。探索它们与AMI患者、远期预后的关系及预测价值。利用Kaplan-Meier法描绘生存曲线,Log-rank检验差异。采用单因素Cox回归分析,根据α=0.10的水准筛选出潜在预后影响因素,筛选出的全部因素纳入Cox回归模型,进行多因素分析。统计学检验水准规定在α=0.05水平。所有统计分析均采用IBM SPSS 25.0统计软件进行分析。4、应用H9C2大鼠心肌细胞,通过质粒构建及转染建立过表达HIF-1α的心肌细胞细胞模型。应用RNA沉默技术建立敲减HIF-1α的细胞模型。分别在常氧、低氧、复氧、低复氧等不同缺氧状态下培养,通过Western Blot蛋白印记方法检测细胞蛋白量表达,检测HIF-1α、自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3、p62）以及凋亡相关蛋白（Bcl-2、Caspase-3、Bax、BNIP3）,进行比较分析。结果:1、研究总共249名急性心肌梗死患者入组,一个月随访死亡2人（0.8%）,MACE事件发生2人（0.8%）;一年随访死亡7人（2.8%）,MACE事件发生55次（22.1%）;五年随访死亡27人（10.8%）,MACE事件发生97人（38.9%）。终点事件为一年MACE时,单因素Cox回归分析显示,年龄（P<0.001）、EF（P=0.017）、rGS（P<0.001）、delta GS（P=0.005）、完全再血管化（P<0.001）、冠状动脉病变支数（P=0.039）、慢性肾功能不全（P=0.002）,可能为一年MACE的独立影响因素。筛选因素纳入Cox多因素回归模型中,年龄（HR=1.031,95%CI:1.004-1.058,P=0.024）、EF（HR=0.969,95%CI:0.940-0.999,P=0.040）、delta GS（HR=0.984,95%CI:0.972-0.997,P=0.013）、完全再血管化（HR=0.381,95%CI:0.162-0.898,P=0.027）是一年MACE的独立影响因素。终点事件为五年MACE时,单因素Cox回归显示,年龄（P<0.001）、EF（P<0.001）、rGS（P<0.001）、完全再血管化（P=0.003）、脑卒中病史（P=0.012）、慢性肾功能不全（P=0.002）、BMI（P=0.043）,可能为五年MACE的独立影响因素。筛选因素纳入Cox多因素回归模型中,EF（HR=0.972,95%CI:0.950-0.995,P=0.015）、rGS（HR=1.009,95%CI:1.001-1.018,P=0.025）是五年MACE发生率的独立影响因素。2、按照rGS中位数分为两组。与低rGS组（rGS≤11）组比较,高rGS组（rGS>11）年龄大（62.0 vs.59.0,P<0.001）、合并慢性肾功能不全及脑卒中的比例高（16.0%vs.6.2%,P=0.013;18.5%vs.8.5%,P=0.020）;单支病变比例低（14.3%vs.67.7%,P<0.001）、完全再血管化的比例低（15.1%vs.81.5%,P<0.001）。分期PCI治疗的比例低（7.6%vs.19.6%,P=0.025）。高rGS组MACE发生高于低rGS组,其中一年MACE、五年MACE、五年死亡率两组间的差异具有统计学意义,高rGS组一年死亡率高于低rGS组,差异没有统计学意义。绘制Kaplan-Meier生存曲线,高rGS组一年累积MACE发生率高于低rGS组,（28.6%vs.16.2%,χ2=6.114,P=0.013）;高rGS组五年累积MACE发生率高于低rGS组,（47.9%vs.30.8%,χ2=8.609,P=0.003）;高rGS组五年累计死亡率高于低rGS组,（15.1%vs.6.9%,χ2=4.497,P=0.034）。单因素Cox回归分析,rGS、delta GS,为一年MACE事件独立影响因素;rGS为五年MACE和死亡独立影响因素。多因素Cox回归分析,年龄（HR=1.031,95%CI:1.004-1.058,P=0.024）、EF（HR=0.969,95%CI:0.940-0.999,P=0.040）、delta GS（HR=0.984,95%CI:0.972-0.997,P=0.013）、完全再血管化（HR=0.381,95%CI:0.162-0.898,P=0.027）是一年MACE的独立影响因素;EF（HR=0.972,95%CI:0.950-0.995,P=0.015）、rGS（HR=1.009,95%CI:1.001-1.018,P=0.025）是五年MACE的独立影响因素;年龄（HR=1.044 95%CI:1.005-1.084,P=0.027）以及EF（HR=0.975,95%CI:0.921-0.994,P=0.027）是五年死亡的独立影响因素。3、两组比较,一年MACE组血清HIF-1α、Bcl-2浓度值低,Beclin-1浓度高,（P<0.001）。五年MACE组血清HIF-1α、Bcl-2浓度值低,Beclin-1浓度高,（P<0.001）。五年死亡组血清Bcl-2浓度值低,（P<0.001）;HIF-1α、Beclin-1浓度略低,无统计学差异。绘制Kaplan-Meier生存曲线,高HIF-1α组一年累积MACE发生率低,（5.6%vs.38.4%,χ2=38.032,P<0.001）;高Beclin-1组一年累积MACE发生率高,（31.5%vs.12.8%,χ2=13.085,P<0.001）;高Bcl-2组一年累积MACE发生率低,（12.9%vs.31.2%,χ2=12.089,P=0.001）。高HIF-1α组五年累积MACE发生率低,（7.3%vs.70.4%,χ2=104.272,P<0.001）;高Beclin-1组五年累积MACE发生率高,（50.8%vs.27.2%,χ2=16.227,P<0.001）;高Bcl-2组一年累积MACE发生率低,（18.5%vs.59.2%,χ2=41.315,P<0.001）。高HIF-1α组五年累积死亡率低,（3.2%vs.18.4%,χ2=14.596,P<0.001）;高Bcl-2组五年累积死亡率低,（4.0%vs.17.6%,χ2=11.51,P=0.001）。单因素Cox回归分析,终点事件为一年、五年MACE时,HIF-1α、Bcl-2、Beclin-1均为MACE的独立影响因素;终点事件为五年死亡时,HIF-1α、Bcl-2为五年死亡的独立影响因素。多因素Cox回归分析,年龄（HR=1.031,95%CI:1.004-1.058,P=0.022）、rGS（HR=1.036,95%CI:1.019-1.054,P<0.001）、HIF-1α（HR=0.019,95%CI:0.005-0.074,P<0.001）、Bcl-2（HR=0.738,95%CI:0.615-0.085,P=0.001）是一年MACE的独立影响因素;年龄（HR=1.029,95%CI:1.008-1.050,P=0.007）、rGS（HR=1.039,95%CI:1.027-1.052,P<0.001）、完全再血管化（HR=0.533,95%CI:0.307-0.927,P=0.026）、HIF-1α（HR=0.010,95%CI:0.004-0.028,P<0.001）、Bcl-2（HR=0.658,95%CI:0.579-0.747,P<0.001）、Beclin-1（HR=1.376,95%CI:1.045-1.790,P=0.023）是五年MACE的独立影响因素;rGS（HR=1.026,95%CI:1.009-1.043,P=0.003）、慢性肾功能不全（HR=3.513,95%CI:1.434-8.609,P=0.006）、HIF-1α（HR=0.177,95%CI:0.046-0.673,P=0.011）、Bcl-2（HR=0.667,95%CI:0.509-0.875,P=0.003）是五年死亡的独立影响因素。4、常氧组、低氧组、低氧复氧组、低氧低复氧组过表达HIF-1α和敲减表达HIF-1α,HIF-1α的表达程度有显着差异,（P<0.05）。低氧组、低氧复氧组、低氧低复氧组HIF-1α的表达程度高于常氧组,（P<0.05）,差异显着。低氧复氧组、低氧低复氧组HIF-1α的表达程度高于低氧组,（P<0.05）,差异显着。低氧复氧组与低氧低复氧组HIF-1α的表达程度无显着差异。常氧组、常氧过表达HIF-1α组、常氧敲减表达HIF-1α组BNIP3的表达程度无差异。低氧低复氧敲减表达HIF-1α组BNIP3的表达程度低于低氧过表达HIF-1α组、低氧复氧过表达HIF-1α组、低氧低复氧过表达HIF-1α组,（P<0.05）,有显着差异。低氧、低氧复氧、低氧低复氧条件下,过表达HIF-1α,BNIP3的表达无差异,（P<0.05）。常氧组Beclin-1的表达程度与低氧敲减表达HIF-1α组、低氧复氧敲减表达HIF-1α组以及低氧低复氧敲减表达HIF-1α组的表达程度,无差异。与低氧复氧组、低氧低复氧组的表达程度无差异。常氧组Beclin-1的表达程度低于低氧过表达HIF-1α组、低氧复氧过表达HIF-1α组、低氧低复氧过表达HIF-1α组,（P<0.05）,有显着差异。常氧组、常氧过表达HIF-1α组、常氧敲减表达HIF-1α组LC3的表达程度无差异。低氧组、低氧复氧组、低氧低复氧组、低氧过表达HIF-1α组、低氧复氧过表达HIF-1α组、低氧低复氧过表达HIF-1α组、低氧敲减表达HIF-1α组、低氧复氧敲减表达HIF-1α组以及低氧低复氧敲减表达HIF-1α组的表达程度均高于常氧组,（P<0.05）,有显着差异。常氧组、低氧组、低氧复氧组、低氧低复氧组p62的表达程度无差异。常氧组p62的表达程度高于常氧过表达HIF-1α组、低氧过表达HIF-1α组、低氧复氧过表达HIF-1α组、低氧低复氧过表达HIF-1α组,（P<0.05）,有显着差异。常氧组p62的表达程度高于低氧敲减表达HIF-1α组、低氧复氧敲减表达HIF-1α组、低氧低复氧敲减表达HIF-1α组（P<0.05）,有显着差异。常氧组Bcl-2表达程度高于低氧过表达HIF-1α和敲减表达HIF-1α组、低氧复氧敲减表达HIF-1α组、低氧低复氧敲减表达HIF-1α组,（P<0.05）,差异有显着性。与其他组无差异。常氧组Bax表达程度低于低氧低复氧组（P=0.0134）、低氧低复氧过表达HIF-1α（P<0.0001）和敲减表达HIF-1α组（P<0.0001）,差异有显着性。与其他组无差异。常氧过表达HIF-1α组Bax表达程度高于低氧复氧组（P=0.0115）,低于低氧低复氧过表达HIF-1α（P=0.0057）和敲减表达HIF-1α组（0.0185）,差异有显着性;与低氧低复氧组无差异（P=0.9568）。常氧组Caspase-3表达程度低于低氧组、低氧复氧敲减表达HIF-1α组、低氧低复氧组、低氧低复氧过表达HIF-1α和敲减表达HIF-1α组,（P<0.05）,差异有显着性。与其他组无差异。经Pearson检验相关性,HIF-1α的表达与BNIP3、Beclin-1、LC3、p62相关,（P<0.05）;BNIP3的表达与HIF-1α、Beclin-1、LC3、p62相关,（P<0.05）;Beclin-1的表达与HIF-1α、BNIP3、p62相关,（P<0.05）;LC3表达与BNIP3、Bax、Caspase-3相关,（P<0.05）;p62表达与HIF-1α、BNIP3、beclin-1相关,（P<0.05）;Bax表达与Caspase-3、LC3相关,（P<0.05）;Caspase-3表达与LC3、Bax相关,P<0.05;Bcl-2表达与其他都不相关。结论:1、年龄、EF值、是否合并慢性肾功能不全、是否为冠脉三支病变等常用的临床指标,在本研究中对一年及五年的MACE事件有预测价值,可为临床决策起到评估和指导作用。是否完全再血管化以及rGS评价了AMI患者PCI治疗后残余动脉粥样硬化负荷,一年及五年的MACE有很好的预测价值。首次发现rGS量化急性心肌梗死患者PCI治疗后动脉粥样硬化的残余负荷,是五年MACE的独立风险因素,rGS可能成为评判心肌缺血缺氧程度的量化标尺,进一步的全面研究将有助于做出治疗急性心肌梗死更优化的临床决策。2、针对动脉粥样硬化负担导致冠心病患者持续存在不同程度的心肌缺氧,rGS作为测量AMI患者残余动脉粥样硬化负担的新工具,反映心肌持续缺氧的程度,是预测急性心肌梗死后5年MACE的独立影响因素,对远期的临床转归具有预测价值。3、HIF-1α、Bcl-2、Beclin-1作为生物标记物与急性心肌梗死患者远期预后存在内在关系,有潜力成为新的预测急性心肌梗死五年MACE和死亡的独立影响因子。缺氧环境下HIF-1α对自噬和凋亡有内在影响,平衡缺氧下心肌细胞的反应状态和代偿能力,决定心肌细胞是否能够存活。急性缺氧下心肌可能通过增加自噬、抑制凋亡的代偿机制存活。4、HIF-1α、BNIP3、LC3、Bax、Caspase-3对缺氧敏感,Beclin-1、p62、Bcl-2对缺氧不敏感。HIF-1α的表达与BNIP3以及自噬蛋白Beclin-1、LC3、p62相关,Bcl-2表达与其他都不相关。缺氧状态下HIF-1α通过调控BNIP3,进一步调控自噬;缺氧状态下自噬与凋亡有交联,互相影响,决定于缺氧持续时间和缺氧程度,缺氧时间长、程度重,凋亡增量更大,细胞活力下降;缺氧时间短、程度轻,自噬增量更大,细胞活力增高。缺氧时,HIF-1α主导调控BNIP3的激活表达,BNIP3、自噬以及凋亡相关蛋白同时受其他因子调控。心肌细胞适应缺氧是一个多途径调控的平衡结果,HIF-1α/BNIP3调控自噬与凋亡是其中途径之一。
黄鹏鹏[2]（2021）在《体外冲击波联合超短波疗法对固定诱导的骨骼肌纤维化和挛缩的影响及可能机制》文中提出目的固定诱导的关节挛缩在早期主要为肌源性挛缩,其主要病理特征为骨骼肌纤维化。已有研究发现,有效的机械刺激和热疗可以改善纤维化相关的疾病。本研究通过观察体外冲击波联合超短波干预对固定诱导的骨骼肌纤维化和挛缩的影响,并探讨其可能机制。方法30只兔接受左侧膝关节完全伸直固定,造成关节挛缩。家兔固定4周后,随机分为模型组（M）、自然恢复组（NR）、体外冲击波治疗组（R）、超短波治疗组（U）、体外冲击波联合超短波治疗组（RU）,每组各6只。作为比较,实验使用6只正常实验兔作为对照组（C）。通过测量膝关节挛缩角度,检测股直肌胶原沉积比例,肌肉横截面积,股直肌中蛋白水平表达,评估体外冲击波和超短波治疗对固定诱导的骨骼肌纤维化和挛缩的影响。结果体外冲击波和超短波联合疗法较单一治疗方法对膝关节功能恢复作用更好。在总挛缩和肌挛缩中,相比较于NR组,各治疗组都有不同程度的恢复,其中RU组改善最多,R组和U组次之（P<0.01）;HE染色显示,RU组相比较于R组肌横截面积增加明显（P<0.01）,但与U组相比无统计学意义（P>0.05）;天狼猩红染色显示,RU组胶原沉积少于U组（P<0.001）,和R组相比胶原沉积减少无统计学意义（P>0.05）;在蛋白表达差异比较中,RU组HIF-1α蛋白表达低于R组和U组（P<0.05）。RU组TGF-β1组蛋白水平明显低于U组（P<0.001）,和R组相比无统计学差异（P>0.05）。结论在兔伸直型膝关节挛缩模型中,体外冲击波联合超短波治疗有利于改善兔膝关节活动范围,缓解骨骼肌纤维化和挛缩,在早期一定程度上逆转关节挛缩的进程。
路远[3]（2020）在《低氧诱导人肝癌细胞差异表达基因分析及SLC6A8基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响》文中认为目的:应用基因芯片技术及信息生物学分析方法,研究人肝癌细胞中与低氧反应相关的差异表达基因,筛选并探讨表达上调且显着差异表达因子--SLC6A8调控肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的机制。方法:采用Affymetrix公司的Gene Chip Clariom S Array芯片,对低氧诱导和常氧培养的Huh-7和Hep3B两株人肝癌细胞基因表达谱进行检测,并应用edge R软件对结果进行分析,研究人肝癌细胞中与低氧反应相关的差异表达基因,筛选出表达上调、变幅最大的差异表达基因。建立人Huh-7和Hep3B肝癌细胞系培养体系。分别构建沉默SLC6A8基因表达的慢病毒载体。分设对照组（Con）、阴性对照组（NC）、siRNA-1（KD1）实验组和siRNA-2（KD2）实验组。采用Q-PCR测试SLC6A8基因的m RNA表达量,Western blot检测HIF-1α和SLC6A8蛋白水平表达量;MTT检测细胞的增殖情况,TUNEL检测细胞的凋亡情况,划痕实验检测细胞的迁移情况,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。对比研究SLC6A8沉默对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。结果:两株细胞系相同的差异表达基因共177个,上调127个,下调的50个;KEGG途径交集分析后选取表达上调且升幅最大的5个基因TXNIP、ATF3、SLC6A8、TIPARP和PFKFB4进行信息查询,结果显示TXNIP、ATF3、SLC6A8、PFKFB4均与肝癌发生相关;TCGA数据库分析发现SLC6A8基因在肝癌组织中的表达显着上升,且其高表达与组织学分型相关。论证实验发现:Huh7细胞KD1、KD2组SLC6A8基因m RNA表达（0.23±0.10,0.61±0.06）显着低于空白对照组（1.00±0.10）和阴性对照组（1.29±0.11）（P<0.05）。SLC6A8蛋白表达水平,KD1、KD2组（0.246±0.003;0.0261±0.003）均低于空白对照组（0.606±0.001）和阴性对照组（0.547±0.004）（P<0.05）;HIF1α的蛋白表达水平,实验KD1、KD2组（0.176±0.001;0.250±0.031）均低于空白对照组（0.435±0.003）和阴性对照组（0.492±0.003）（P<0.05）。Hep3B细胞中的SLC6A8基因的m RNA表达量水平,KD1、KD2实验组（0.47±0.05,0.75±0.12）明显低于空白对照组（1±0.07）和阴性对照组（1.36±0.05）（P<0.05）。SLC6A8蛋白表达水平,实验KD1、KD2组（0.299±0.008;0.159±0.005）均低于空白对照组（0.818±0.007）和阴性对照组（0.692±0.004）（P<0.05）;HIF1α的蛋白表达水平,实验KD1、KD2组（0.228±0.010;0.134±0.003）均低于空白对照组（0.556±0.002）和阴性对照组（0.516±0.006）（P<0.05）。两组细胞实验中,沉默SLC6A8后,MTT技术检测细胞增殖情况,显示KD1、KD2细胞增殖和细胞活性均明显降低。TUNEL染色显示KD1和KD2组均出现深棕色,提示细胞凋亡增加。在Hep3B细胞中,随着病毒感染时间延长,KD1和KD2均有抑制细胞迁移的作用（P<0.05）,与相KD2比较,KD1的抑制效果更明显（P<0.05）;在Huh-7细胞中,感染24 h后细胞迁移率均增加,感染48 h后,KD1和KD2均有抑制细胞迁移的效果（P<0.05）,但KD1与KD2相比较,无显着性差异（P﹥0.05）。沉默SLC6A8基因降低了Huh-7、Hep3B细胞的侵袭能力（P<0.05）,但KD1与KD2相比较,无显着性差异（P﹥0.05）。结论:人肝癌Huh-7及Hep3B细胞低氧培养后,大量的细胞因子表达异常;TXNIP、ATF3、SLC6A8、TIPARP和PFKFB4等是5个表达上调、升幅最大的差异基因,这些低氧诱导表达增高的差异基因可能与肝癌发生发展相关;生物信息学分析表明,SLC6A8基因在肝癌组织中的表达显着上升,其高表达与组织学分型相关。在肝癌细胞系中SLC6A8高表达。低表达的SLC6A8能抑制细胞的增殖、侵袭、迁移,并诱导细胞凋亡。沉默SLC6A8后HIF-1α的蛋白表达水平下降,提示SLC6A8可能是HIF-1α的上游驱动子,SLC6A8与HIF-1α有正向的网络调控关系,并通过HIF-1α介导了肝癌细胞的生物学改变。
米晓钰[4]（2020）在《Ngb和HIF-1α在牦牛与黄牛不同脑组织表达与分布的比较研究》文中指出脊椎动物中枢神经系统对低氧具有高度的敏感性,作为对低氧环境具有长期适应性的物种——牦牛（Bos grunniens）,其中枢神经系统,特别是脑,也必然有其特殊的适应机制。脑红蛋白（Neuroglobin,Ngb）和缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）,是两种已被证实与机体高海拔缺氧适应相关的调节蛋白,主要在脊椎动物神经系统中高表达,并且,已有研究发现在缺血缺氧性脑损伤中,HIF-1α可促进Ngb生成。目前,对于高寒低氧环境下牦牛不同脑组织中Ngb和HIF-1α的表达与分布特征仍不清楚。因此,为深入探究牦牛不同脑组织在适应高寒低氧环境过程中Ngb和HIF-1α的表达及相互作用关系,本研究利用qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学技术,对牦牛脑不同区域组织中Ngb和HIF-1α的表达与分布特征进行研究,同时与平原黄牛作比较。具体研究结果如下:1)在牦牛和黄牛端脑不同组织中,Ngb和HIF-1αmRNA和蛋白均有不同程度的阳性表达,且表达趋势基本一致,其中,顶叶皮质Ngb和HIF-1αmRNA和蛋白表达量最高（P<0.05）。相比较而言,牦牛端脑不同组织Ngb mRNA表达量均高于黄牛;HIF-1αmRNA的表达量除在顶叶皮质中牦牛表达量较黄牛高外,其余区域与黄牛基本一致。Ngb蛋白在牦牛端脑的表达量除梨状叶外其余区域均高于黄牛;HIF-1α蛋白在黄牛的表达量除扣带回外其余区域均高于牦牛。免疫组织化学结果显示,Ngb和HIF-1α在牦牛和黄牛端脑不同区域的分布特征相似,主要位于端脑大部分区域的神经元胞质或少部分神经胶质细胞中,阴性对照均无表达。2)在牦牛和黄牛间脑不同组织中,Ngb和HIF-1αmRNA与蛋白均有不同程度的阳性表达,且表达量趋势基本一致,其中,牦牛间脑Ngb和HIF-1αmRNA均在脑垂体和松果体中表达量最高（P<0.05）;黄牛间脑Ngb和HIF-1αmRNA均在脑垂体中表达量最高（P<0.05）。相比较而言,Ngb与HIF-1αmRNA在牦牛脑垂体与松果体中的表达量较黄牛高,其余区域表达量基本一致。牦牛间脑Ngb蛋白在脑垂体和下丘脑表达量最高（P<0.05）,HIF-1α蛋白仅在脑垂体表达量最高（P<0.05）;黄牛脑垂体中Ngb和HIF-1α蛋白的表达量最高（P<0.05）。相比较而言,Ngb和HIF-1α蛋白在牦牛间脑各区域表达量均高于黄牛。免疫组织化学结果显示,Ngb和HIF-1α在牦牛和黄牛间脑不同区域的分布特征相似,主要位于间脑各区域的神经元胞质中,阴性对照均无表达。3)在牦牛和黄牛菱脑不同组织中,Ngb和HIF-1αmRNA和蛋白均有不同程度的阳性表达,且表达趋势基本一致,其中,牦牛菱脑Ngb和HIF-1αmRNA和蛋白均在蚓前叶表达量最高（P<0.05）;黄牛菱脑Ngb mRNA和蛋白仅在蚓前叶表达量最高（P<0.05）,而HIF-1αmRNA和蛋白在蚓前叶与小脑半球皮质表达量均为最高（P<0.05）。相比较而言,Ngb mRNA在牦牛小脑半球白质中的表达量较黄牛低,其余区域表达量基本一致;HIF-1αmRNA在牦牛小脑半球白质、蚓后叶和蚓小叶中的表达量较黄牛低,其余区域表达量基本一致。Ngb蛋白在牦牛小脑半球白质和蚓小叶中的表达量较黄牛低,其余区域表达量牦牛高于黄牛,HIF-1α蛋白在牦牛菱脑中的表达量均高于黄牛。免疫组织化学结果表明,Ngb和HIF-1α在牦牛和黄牛菱脑不同区域的分布特征相似,主要位于神经元胞质,阴性对照均无表达。4)牦牛端脑、间脑、菱脑大部分区域的Ngb和HIF-1α在基因及蛋白水平的表达趋势一致,呈正相关,但在个别区域,存在基因和蛋白表达不一致的现象;而黄牛端脑、间脑、菱脑各区域组织中Ngb和HIF-1α在基因和蛋白水平的表达趋势均一致。上述研究结果表明,牦牛和黄牛不同脑组织中,均有Ngb和HIF-1α基因与蛋白不同程度的阳性表达,说明了二者进化的保守性。其中,Ngb和HIF-1α基因和蛋白分别在牦牛与黄牛顶叶皮质、脑垂体、蚓前叶的表达量最高,说明三者对缺氧具有较高的敏感性和耐受性;牦牛与黄牛脑组织大部分区域中,Ngb和HIF-1α的表达与分布规律基本一致,提示HIF-1α可能对Ngb存在直接或间接的协同作用,以提高牦牛与黄牛脑对低氧环境的适应能力。相较于黄牛,牦牛脑组织某些特定区域存在Ngb和HIF-1α基因与蛋白水平表达差异的现象,分析其原因可能与牦牛脑组织相应区域Ngb和HIF-1α所执行功能的不同以及机体在长期适应高寒低氧环境过程中的优先选择性表达有关联,其具体机制尚有待进一步试验验证。
张佳莹[5]（2020）在《线粒体通路信号介导细胞凋亡机制及对宰后牛肉嫩化影响》文中进行了进一步梳理嫩度是决定牛肉食用品质及影响消费者购买力的重要指标之一。宰后成熟过程是提高牛肉嫩度的重要途径。近年来,线粒体Cyt-c介导Caspase活化机制作为改善肌肉嫩度的新的贡献者,与骨骼肌宰后成熟嫩化过程密切相关。目前研究认为,Caspase的广谱抑制剂并不能够完全阻止线粒体Cyt-c介导的Caspase凋亡途径的发生,由此出现了线粒体AIF路径。此外,溶酶体也能通过经典的线粒体凋亡途径参与细胞凋亡过程,但是,其参与骨骼肌宰后成熟嫩化机理未见报道。本文以西门塔尔杂交牛背最长肌（LD）、肱三头肌（TB）和半腱肌（ST）为研究材料,探究了牛肉背最长肌成熟过程中线粒体Cyt-c释放及介导Caspase凋亡机制、凋亡过程中Cyt-c高级结构的变化及对细胞凋亡的影响;解析了线粒体AIF释放及介导细胞凋亡机制、AIF释放与Cyt-c介导的Caspase凋亡途径的关系;阐明了溶酶体-线粒体凋亡途径以及溶酶体Fe介导背最长肌宰后成熟过程细胞凋亡机制及对肌肉蛋白降解与嫩度的影响;明确了不同肌肉类型（背最长肌、肱三头肌和半腱肌）线粒体凋亡途径的发生对骨骼肌蛋白降解及嫩化的影响,以期为全面阐明线粒体细胞凋亡途径及不同部位肌肉的宰后成熟嫩化机制提供新视角。1.解析了线粒体Cyt-c介导凋亡的发生机制及对肌肉嫩度的影响。宰后612 h,胞浆Cyt-c含量显着上升（P<0.05）,Caspase-9、-3活力分别于12 h和24 h达到最大值,凋亡细胞核于24 h显着增加（P<0.05）,表明Cyt-c从线粒体释放后启动上游Caspase-9,激活下游Caspase-3并介导凋亡发生时的整个过程发生在宰后前期。pH值于宰后072h显着降低（P<0.05）,线粒体膜通透性于宰后624 h显着上升（P<0.05）,此过程正是Cyt-c释放及介导Caspase-3活化的时期,说明牛肉宰后成熟过程中胞浆酸化和线粒体膜通透性增大是Cyt-c释放和Caspase活化发生的生理保证和必要条件。此外,线粒体Cyt-c介导细胞凋亡的发生与Cyt-c高级结构Fe配体振动拉曼光谱频率显着相关。Fe配体振动拉曼光谱频率随宰后成熟时间的增加逐渐红移（右移）,Cyt-c与线粒体结合更加紧密,诱导细胞凋亡的发生。并且,宰后0168 h,剪切力呈先升高后降低的趋势（P<0.05）,Caspase-3活性与剪切力显着相关（r=0.762,P<0.05）,表明宰后成熟过程显着提高了牛肉嫩度,凋亡效应酶Caspase-3参与了牛肉嫩化机制。2.揭示了线粒体AIF介导凋亡的发生机制（与Cyt-c介导的Caspase途径的关系）及对肌肉嫩度的影响。宰后672 h,线粒体AIF表达量显着降低（P<0.05）。宰后12120h,细胞核AIF表达量显着升高（P<0.05）。随着成熟时间的延长,细胞核体积逐渐增大,部分细胞核溶解并破裂,并伴随着细胞皱缩、细胞间隙变大的现象。在Caspase抑制剂作用下,线粒体AIF表达、细胞核体积及形态均未发生变化（P>0.05）,表明从宰后6 h开始,AIF从线粒体释放进入细胞核介导Caspase依赖性细胞凋亡的发生,即线粒体AIF的释放依赖于线粒体Cyt-c介导的Caspase凋亡途径。此外,随着AIF从线粒体的释放,线粒体肿胀增加（P<0.05）、ROS含量和Ca2+浓度上升（P<0.05）,钙蛋白酶和组织蛋白酶被活化（P<0.05）。Caspase抑制剂通过抑制线粒体肿胀加剧、ROS含量和Ca2+浓度增加、钙蛋白酶和组织蛋白酶活化（P<0.05）,显着抑制了AIF释放及细胞凋亡的发生,表明线粒体肿胀、ROS含量、Ca2+浓度、钙蛋白酶及组织蛋白酶活化均可影响线粒体AIF的释放。此外,Caspase抑制剂通过抑制AIF的释放显着增加了剪切力值（P<0.05）,表明线粒体AIF介导的细胞凋亡对牛肉宰后成熟嫩化具有积极作用。3.明确了溶酶体（组织蛋白酶）-线粒体途径介导凋亡的发生机制及对肌肉嫩度的影响。由2可知,组织蛋白酶是影响线粒体凋亡蛋白释放的因素之一。牛肉宰后成熟过程中产生ROS（P<0.05）靶向作用于溶酶体,破坏溶酶体膜稳定性（P<0.05）,进而释放组织蛋白酶B和组织蛋白酶D（P<0.05）。ROS破坏溶酶体膜稳定性是由于溶酶体膜中Fe的累积造成的。组织蛋白酶D抑制剂Pepstatin A显着抑制了Bid和Bax表达、线粒体膜通透及Caspase活性（P<0.05）表明溶酶体组织蛋白酶D通过激活Bid和Bax蛋白引发线粒体膜通透,进而启动细胞凋亡的发生。并且溶酶体膜失稳是线粒体膜通透的上游事件。此外,组织蛋白酶D,而非组织蛋白酶B,通过参与线粒体细胞凋亡进而改善了肌肉嫩度。4.溶酶体Fe介导线粒体凋亡途径发生有助于宰后肌肉蛋白降解。由3可知,溶酶体Fe累积破坏上游溶酶体膜稳定性并可能参与下游线粒体凋亡途径。Fe螯合剂DFO降低了线粒体膜通透性、Ca2+浓度和Cyt-c氧化水平,增加了线粒体膜电位（P<0.05）,表明溶酶体Fe诱导线粒体膜发生损伤,Ca2+积累以及Cyt-c氧化水平升高,从而介导细胞凋亡发生。此外,DFO组Cyt-c和Bid表达量显着升高（P<0.05）,Caspase-9和Caspase-3活性未发生改变,表明溶酶体Fe能够促进线粒体Cyt-c和Bid蛋白表达并激活Caspase-9和Caspase-3,进而引发细胞凋亡。另外,在DFO的作用下,Desmin和Troponin-T的完整片段在宰后后期显着高于对照组,蛋白降解片段显着低于对照组（P<0.05）,表明Fe通过参与线粒体凋亡蛋白介导的Caspase级联反应从而改善了肌肉嫩度。5.线粒体细胞凋亡介导骨骼肌肌原纤维蛋白降解和肌肉嫩化是不同部位肌肉特异性的。不同部位牛肉（TB、LD和ST）在宰后成熟过程中线粒体膜通透性和脂质过氧化程度均增大,Cyt-c表达量均降低,Caspase-9和Caspase-3被激活,Ca2+浓度和Cyt-c氧化水平均显着升高,Desmin和Troponin-T在宰后成熟后期发生降解（P<0.05）,表明三种不同肌肉类型牛肉在宰后成熟过程发生了细胞凋亡,并介导骨骼肌肌原纤维蛋白发生降解,改善了肌肉嫩度。与LD和ST相比,TB表现出较高凋亡潜能,而LD却表现出较高的蛋白降解程度,TB具有较高的线粒体凋亡潜能却没有表现出最大的蛋白降解程度,表明线粒体细胞凋亡介导骨骼肌肌原纤维蛋白降解和肌肉嫩化是肌肉特异性的。
刘大海[6]（2020）在《双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制》文中研究说明研究背景血管瘤是常见的良性病变,由中胚层血管组织过度增生引起。血管瘤会给患者带来沉重的身心负担,尤其是对于皮肤病变患者。药物治疗和外科手术是血管瘤治疗的主要方法。但是,仍然有25%的血管瘤患者接受切除手术后仍存在症状。据报道,约75%–80%的血管瘤患者是女性。女性优势的详细原因尚不清楚。据报道,健康儿童的雌二醇水平低于血管瘤患者。增殖的血管瘤组织中的血清雌二醇水平高于渐开线阶段的水平。实验室研究表明,雌激素可促进血管瘤细胞的体外增殖,这可能取决于某些生长因子并被他莫昔芬抑制。此外,雌激素和VEGF对血管瘤细胞的增殖具有协同作用。所有这些数据表明,雌激素信号对血管瘤进展具有积极作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是6个配体家族。VEGFA是与内皮增殖,迁移和存活相关的主要生长因子。成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGFs）由22个分子组成,与结构相关。根据新的命名法,FGF被连续编号,碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）被称为FGF-2。FGF和VEGF诱导的形态差异毛细血管论证了这些生长因子在血管生成中的不同作用。众所周知,VEGF是血管通透性的强力诱导剂,可引起水肿并导致高浓度血管瘤的形成。但是,尚未报告这些有害作用与此相关,反而FGF诱导的新形成的血管通常情况下功能表征成熟,且毛细血管壁细胞增加了。双酚S可以通过Snail的诱导在血管瘤细胞中诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。目的:（1）探究双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子诱发血管瘤细胞恶性变的机制。（2）探究BPS通过增加HA细胞中碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）的表达增加HA细胞增殖和迁移的机制。（3）探究BPS通过激活和增加HIF-1α增加bFGF表达的分子机制。（4）探究BPS通过上调HIF-1α和下调miR-195来增加bFGF的表达来触发HA细胞的恶性发展的机制。方法:（1）原代HA衍生内皮细胞（HDEC）和CRL‐2586细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养保存,使用含有相同浓度（小于0.5%）的DMSO（对细胞无毒作用）的培养基作为对照。细胞增殖测定,细胞群落形成试验,细胞周期分析,实时RT-PCR分析,蛋白质印迹分析,酶联免疫吸附试验,启动子活性分析。（2）研究中使用血管瘤来源的内皮细胞（Hemangio-derived endothelial cells,HDEC）,将细胞保存在含有10%的内皮基础培养基（EBM-2）中。将HDEC接种于RPMI1640中,其中补充了10%热灭活的胎牛血清,链霉素和青霉素（100U/mL）,于37℃,5%CO2的湿润气氛下培养。根据实验要求将细胞分为以下几组:对照组（正常培养的细胞系作为实验对照）,BPS处理组（使用浓度80μM的BPS处理细胞）,miR-424的过表达组（将100 pmol miR-424模拟物添加到HDEC进行转染）,抑制剂组（使用BAY 11-7082对BPS诱导的HDEC进行处理）。逆转录定量PCR（RT-qPCR）实时分析bFGF、VEGF、FGFR1、p65 mRNA表达。用MTT测定法分析HDEC增殖活力。流式细胞仪分析细胞凋亡。Transwell分析检测细胞迁移。蛋白质印迹分析检测miR-424对bFGF/FGFR1通路蛋白表达的影响。（3）内皮细胞系来源于血管瘤组织,在补充有10 ng/ml表皮生长因子和15%胎牛血清加上100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基（Invitrogen,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国）中培养细胞系,环境温度37°C下,含有5%CO2的潮湿环境。根据实验将培养细胞分为以下分组:对照组（正常培养的细胞系作为实验对照）,BPS处理组（用100μMBPS处理细胞,并孵育24小时）,HIF-1α抑制组（BPS处理前使用一定浓度的HIF-1α抑制剂NS398同细胞一起孵育）,siRNA敲低HIF-1α组（使用X-tremeGene siRNA转染试剂在不含抗生素的人内皮无血清培养基中进行转染,每个样品使用1μg siRNA）,除实验处理不同外各组细胞的培养条件都相同。蛋白印迹分析细胞中HIF-1α及bFGF蛋白表达;MTT测定细胞增殖;TUNEL分析细胞的凋亡情况;逆转录定量PCR（RT-qPCR）实时分析STAT3和Bcl-2的mRNA表达。（4）作为双酚A（Bisphenol A,BPA）的替代品,双酚S（Bisphenol S,BPS）已应用于我们日常生活中的消费产品。具有与BPA类似的化学结构,BPS还被证明是一种外源性内分泌干扰化学物质。HA来源的内皮细胞（HA-derived endothelial cells,HDEC）细胞系购自北京安必奇生物科技有限公司。HDEC细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加10%热灭活的胎牛血清,100 U/每毫升青霉素和100μg/mL链霉素将其置于37°C含5%CO2的潮湿气氛中。将Lv-HIF-1α过表达载体和miR-195模拟物或抑制剂转染到HAs细胞中,并进行进一步的功能实验。通过蛋白质免疫印迹检测BPS诱导后miR-195、bFGF和VEGF蛋白含量。通过MTT测定法评价细胞增殖活性。通过流式细胞仪分析细胞凋亡指数。使用miRWalk 2.0进行生物信息分析,筛选miR-195的靶基因。将带有HIF-1α野生型（WT）3’-UTR或突变的3’-UTR的pmirGLO报告载体与miR-195模拟物或抑制剂共转染入HDEC细胞。转染后48小时,用双重荧光素酶报告系统检查荧光素酶活性。通过qRT-PCR检测miR-195、HIF-1α和bFGF的表达。结果:（1）细胞群落形成分析表明,10nm BPS也能显着地触发HDEC和CRL-2586细胞的定植。细胞周期分析表明,BPS组G0/G1期细胞数量减少。BPS可通过诱导细胞周期转换而触发HA细胞的增殖。在BPS HA细胞增加bFGF的表达。bFGF参与了BPS诱导的HA细胞增殖。bFGF可以提高bFGF的转录和mRNA的稳定性。NF-κB参与BPS诱导的HA细胞bFGF表达。miR-155-5p参与BPS增加的bFGF mRNA稳定性。（2）BPS处理组较对照组bFGF、VEGF、FGFR1的mRNA表达升高（P<0.05）。说明BPS促进血管瘤细胞bFGF、VEGF、FGFR1的转录表达。第24小时和第36小时BPS处理组较对照组细胞增值率升高（P<0.05）,第72小时BPS处理组较对照组细胞增值率升高（P<0.01）。BPS处理组较对照组细胞凋亡率降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组细胞活力升高（P<0.05）。BPS处理组较对照组细胞迁移数量增加（P<0.05）,BPS处理组较对照组细胞侵袭数量增加（P<0.05）,说明BPS可促进细胞的迁移侵袭。抑制剂组较BPS处理组p65mRNA表达升高（P<0.05）,BPS处理组较对照组p65mRNA表达无差异（P>0.05）,抑制剂组较BPS处理组和对照组bFGFmRNA表达降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组bFGFmRNA表达升高（P<0.05）。miR-424的过表达组较BPS处理组和对照组bFGF/FGFR1、ERK1/2蛋白表达降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组bFGF/FGFR1、ERK1/2蛋白表达升高（P<0.05）。说明miR-424的过量表达阻断了bFGF/FGFR1途径,且miR-424过表达显着抑制ERK1/2磷酸化。（3）BPS（0μM）较BPS（50μM）HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）,BPS（50μM）较BPS（200μM）HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）,结果表明,BPS以剂量依赖的方式促进了HIF-1α、bFGF的蛋白表达。第72小时较第48小时、24小时HIF-1α及bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,第48小时较第24小时HIF-1α及bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,表明,HIF-1α和bFGF表达在24 h时增加,并持续增加直至72 h。通过MTT测定细胞增殖力情况,第24小时、48小时BPS处理组较对照组细胞增殖增加（P<0.05）,第72小时对照组较BPS处理组细胞增殖降低（P<0.01）。BPS处理组较对照组HIF-1α、bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,HIF-1α抑制组较BPS处理组HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）。结果表明,BPS对细胞的影响通过是通过HIF-1α的激活来增加bFGF的蛋白表达。对照组较BPS处理组STAT3、Bcl-2 mRNA表达降低（P<0.05）,siRNA敲低HIF-1α组较BPS处理组STAT3、Bcl-2 mRNA表达降低（P<0.05）。siRNA敲低HIF-1α降低STAT3和Bcl-2的mRNA表达,这些结果表明HIF-1α在BPS介导的血管瘤细胞对STAT3信号的促进中起着重要作用。（4）HA组较对照组miR-195蛋白含量降低、bFGF和VEGF蛋白含量升高,BPS诱导组较HA组miR-195蛋白含量进一步降低、bFGF和VEGF蛋白含量进一步升高（P<0.05）。miR-195模拟物转染组（2.53±0.37,8.53±0.85）较空白对照组（3.46±0.52,2.17±0.24）细胞增殖活性降低,细胞凋亡率增加（P<0.05）。miR-195抑制剂转染组（3.89±0.22,2.11±0.23）较空白质粒转染组（2.37±0.26,5.64±0.16）细胞增殖活性增加,细胞凋亡率降低（P<0.05）。miR-195模拟物降低了HIF-1αWT 3’-UTR的萤光素酶活性,而miR-195抑制剂增强了该效果,但它们均对HIF-1α突变3’-UTR的萤光素酶活性没有影响。miR-195模拟物增加了miR-195的表达,降低了HIF-1α和bFGF的表达,而miR-195抑制剂则降低了miR-195的表达,增加了HIF-1α和bFGF的表达。结论:（1）BPS可以通过诱导细胞增殖和细胞周期转换而引发HA细胞的恶性变,该过程是通过BPS激活p65造成miR-155-5p下调,使得bFGF的表达增加而实现的。（2）BPS可以诱导细胞增殖触发HA细胞肿瘤的发生,该过程通过激活ERK1/2和了bFGF/FGFR1信号通路,上调bFGF的表达,促进HA细胞的增殖迁移完成的。（3）BPS通过激活和增加缺氧诱导因子（HIF）-1α来促进bFGF在血管瘤细胞中的表达,诱导血管瘤细胞的增殖发展。（4）miR-195通过靶向HIF-1α,调控bFGF和VEGF的表达,促进BPS诱导的HA细胞的增殖并抑制其凋亡,抑制皮肤HA的发展。并且miR-195上调和HIF-1α下调为HAs提供了潜在的治疗靶标。由于产前时期对BPS暴露敏感,我们建议孕妇和婴儿应特别注意避免暴露于BPS（例如,减少使用塑料制品,PCP,罐头食品以及与热敏纸的皮肤接触）。
赵良中[7]（2020）在《靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究》文中研究表明由病毒感染、肝毒素、酒精摄入或药物引起的肝损伤已成为世界范围内严重的人类健康问题,其发病率不断上升。目前,除了肝移植治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝损伤外,没有有效的治疗方法。然而,由于供体组织的来源有限且成本高昂,严重限制了通过肝移植进行的治疗。因此,迫切需要探索新的有效的预防和治疗策略。过量服用对乙酰氨基酚（4’羟基乙酰苯胺,扑热息痛,APAP）已成为药物引起的急性肝衰竭的最常见原因。APAP诱导急性肝损伤（APAP-induced liver injury,AILI）的研究显示,血管生成和氧化还原稳态在肝保护和修复中起着重要作用。低氧诱导因子-1（HIF-1）是一种转录因子,在调节血管生成、氧化还原稳态和能量平衡相关基因的表达中发挥关键的调节作用。在包括急性肝损伤在内的急性组织损伤过程中,HIF-1作为急性低氧应激最敏感的因子,它的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。HIF-α上的脯氨酸残基可以被细胞内的脯氨酰羟化酶（PHDs）羟化,羟化后的HIF-α通过泛素-蛋白酶体途径降解,因此,PHD是调节细胞中HIF-α稳定性的限速酶。其中PHD2是催化HIF-1α脯氨酸羟化的关键限速酶。研究表明,抑制PHD2的活性导致HIF-1α的稳定,从而增强了HIF-1下游大量靶基因的诱导,这些基因调节广泛的低氧反应,如血管生成,能量补偿,氧化还原,pH稳态以及许多其他过程,最终改善急慢性低氧时组织损伤。因此,PHD2已成为促进血管生成和组织损伤修复的一个潜在靶点。鉴于目前PHDs抑制剂缺乏特异性和靶向性,会产生大量的毒副作用,因此如何获得高效特异抑制PHD2活性的抑制剂备受关注。由于抗体具有高特异性和高亲和性作用特点,近年来备受关注。随着抗体工程技术的发展,派生出来的胞内抗体技术,通过对抗体分子的适当修饰,实现细胞内重要靶分子的表型敲除。为此,本研究利用胞内抗体技术制备了一种在细胞内靶向失活PHD2的胞内单链抗体,并对其生物学活性和在APAP肝损伤中的作用进行研究。课题组前期研究中纯化了人源PHD2蛋白,以此蛋白为抗原,通过噬菌体库筛选的方法获得了抗PHD2单链抗体（scFv）,并且通过可溶性表达、纯化及ELISA分析,发现此scFv能够特异性结合重组PHD2。本研究为了靶向失活细胞内的PHD2,以抗PHD2的scFv基因为模板,用内质网（ER）滞留信号序列修饰,从而制备了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）,检测此胞内抗体是否会在细胞中成功表达,并对其活性进行表征,然后探讨了ER-INP在小鼠APAP诱导的急性肝损伤中的作用和可能的机制。取得如下结果:一、成功构建了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）。以抗PHD2人源单链抗体scFv基因为模板,通过PCR引入滞留于内质网的细胞内定位信号和E-tag序列,成功制备内质网滞留型抗PHD2胞内抗体基因ER-INP,并将其克隆入真核表达载体中构建重组人ER-INP真核表达载体pER-INP。将pER-INP转染进细胞中,RT-PCR、免疫荧光和Western blot实验分析结果表明,引入内质网定位信号和E-tag序列的抗PHD2胞内抗体基因能够在细胞中有效表达和实现目标蛋白的内质网定位。二、抗PHD2胞内抗体特异性结合细胞内PHD2并抑制其脯氨酰羟化酶活性。将pER-INP转染进细胞中,免疫共沉淀实验、Western blot和免疫荧光实验分析抗PHD2胞内抗体的作用效能。结果表明,细胞内表达的抗PHD2胞内抗体ER-INP能够识别并结合细胞内的PHD2蛋白,抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,即抑制其羟化HIF-1α的Pro564和Pro402的活性,明显上调HIF-1α的蛋白水平。三、抗PHD2胞内抗体在体外和体内均显示出明显的促血管生成活性。为了检测ER-INP在体外和体内是否具有促血管生成活性,分别采用划痕实验检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移能力,3D培养模型来检测HUVEC的成管能力,利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAMs）模型来检测其体内血管生成情况。通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等实验方法分析HIF-1下游促血管生成相关靶基因的表达。实验结果表明ER-INP的表达显着促进了HUVEC的迁移和管状形成能力,并增强了鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成能力。此外,实时定量PCR检测结果表明ER-INP促进了HIF-1下游促血管生成相关靶基因VEGF、ANGPTL-2、MMP-2和MMP-13等的表达,而且Western blot和ELISA结果表明ER-INP显着提高VEGF、MMP-2和MMP-13等促血管生成因子的蛋白水平。四、抗PHD2胞内抗体保护APAP诱导的急性肝损伤。将带有GFP的对照质粒尾静脉注射入小鼠体内,发现从注射后的第1天到第3天可以检测到该蛋白的表达,第3天在肝脏中的表达达到最高水平,由此推测该表达载体携带的ER-INP基因尾静脉注射入小鼠体内后可能主要在肝脏中表达,并在第3天达到最高水平;和对照组相比,正常小鼠尾静脉注射表达ER-INP的质粒不影响肝脏的组织形态学以及小鼠血清谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）水平,总之ER-INP不损害小鼠肝脏,并且ER-INP可以在小鼠肝脏中成功表达;小鼠腹腔注射250 mg/kg剂量的APAP溶液,于注射后24 h,48 h和72 h处死小鼠,发现24 h达到肝损伤的高峰期,表现为ALT和AST水平显着升高以及肝脏小叶中央区出现明显的坏死,而尾静脉注射表达靶向PHD2胞内抗体ER-INP质粒预处理48 h后再给予APAP,可显着抑制APAP引起的血清ALT和AST的升高以及肝小叶中央区的坏死也明显改善。五、ER-INP对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制。一方面,ER-INP预处理的APAP肝损伤小鼠肝组织出现了明显促血管生成效应,表现为免疫组化结果显示肝脏中血管新生标志分子CD31表达明显上调,同时具有促血管生成作用的HIF-1α水平显着上调,Western blot和ELISA结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF和MMP-2的蛋白表达水平明显上调,实时定量PCR结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF、ANGPTL-2和MMP-2的基因转录水平明显上调;另一方面,ER-INP预处理有利于维持APAP肝损伤小鼠肝组织的氧化还原稳态,表现为ER-INP预处理显着抑制肝脏氧化应激标志分子丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平,Western blot结果显示ER-INP预处理显着抑制了内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）水平的升高,然而显着增强抗氧化酶即过氧化物氧化还原酶4（peroxiredoxin 4,PRDX4）的活性和显着抑制抗氧化分子即谷胱甘肽（L-glutathione,GSH）的消耗。总之,ER-INP可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的急性肝损伤。综上所述,成功制备在细胞内特异性结合PHD2的胞内抗体ER-INP,靶向PHD2的胞内抗体能够在体内外抑制PHD2活性,提高HIF-1α的稳定性,促进HIF-1下游靶基因的转录激活,可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的肝损伤,这为组织损伤和局部缺血性疾病的临床治疗开辟了新途径,为新药研发提供了新思路和实验依据。
陈艳芳[8]（2020）在《KDR突变在神经内分泌型前列腺癌中的作用及对KDR抑制剂疗效的预测作用》文中提出目的:旨在探讨血管内皮生长因子受体-2（VEFGR-2/KDR）在神经内分泌型前列腺癌（NEPC）组织中的表达差异及其与NEPC的临床分期、血清PSA水平、Gleason评分及患者生存之间的关系,并进一步在体外细胞水平及体内动物实验验证KDRQ472H突变与肿瘤细胞的增殖能力及侵袭能力的关系,同时通过体外和体内实验探讨该突变位点是否是血管内皮生长因子受体-2的小分子酪氨酸激酶抑制剂（VEGFR2-TKI）阿帕替尼的有效位点以及进一步分析KDR突变和VEGFR2-TKI疗效的相关性。最终鉴定KDR突变在NEPC的发生发展及治疗中的作用。方法:1.将前期收集的20例NEPC患者,根据二代测序结果分为KDR突变组及KDR野生组两组。应用免疫组化检测在20例NEPC临床样本中KDR蛋白的表达差异。并将免疫组化结果与患者的临床分期、血清PSA水平及Gleason评分等之间的关系进行统计学分析及生存预后分析;2.培养NEPC细胞系PC3,构建KDRQ472H突变体质粒。建立稳定过表达KDRQ472H及过表达KDRwt的PC3细胞株。通过细胞计数、平板克隆实验、划痕实验及Transwell侵袭实验验证过表达KDRQ472H及过表达KDRwt的细胞株的增殖能力和迁移侵袭能力,应用Western blot方法检测突变体系中相关信号分子的表达情况。应用不同浓度的药物（阿帕替尼）干预各组细胞系,进行侵袭和增殖实验,检测各组细胞系对于阿帕替尼的敏感性,从而验证KDR突变对VEGFR2-TKI的疗效的预测作用。3.分别将过表达KDRQ472H及过表达KDRwt的PC3细胞株,接种裸鼠,通过裸鼠皮下成瘤实验,进一步验证KDR基因突变的恶性生物学行为以及KDR突变后对于阿帕替尼药物的敏感性。最后通过三部分的实验结果,综合评估KDR突变在神经内分泌型前列腺癌发生发展中的生物学作用,以及VEGFR2-TKI对KDR突变型NEPC的抑制作用。结果:1.免疫组化方法对20例临床标本进行KDR蛋白表达检测结果:突变组所有患者KDR表达都是阳性,高表达率为75%,未突变组KDR高表达率为19%,突变组与未突变组比较表达有明显统计学差异（P=0.032）。从结果可以看出,KDR突变的患者的蛋白表达明显高于KDR未突变的患者。对这些资料进行临床病理分析,单因素和多因素分析结果显示:确诊NEPC时转移灶≥3和KDR高表达患者的生存期分别短于转移灶<3及KDR低表达的患者,是患者生存的独立预后因素。2.将空载体质粒、KDR野生型质粒和KDRQ472H突变体质粒分别转染到PC3细胞系中,经筛选建立稳定过表达KDRQ472H及过表达KDRwt的PC3细胞株。转染成功后,进行MTT增殖实验及平板克隆实验,结果显示:转染突变体质粒的细胞系增殖能力大于其他各组细胞,统计学具有显着性差异（P<0.05）。细胞划痕实验结果示:KDR突变组细胞伤口愈合百分比最高,与其他各组比较具有显着性差异（P<0.05）。Transwell实验结果证明KDRQ472H突变组细胞侵袭数目明显大于其他组细胞（P<0.05）。Western blot实验结果示KDRQ472H突变促进了ERK的磷酸化。体内动物实验结果:接种过表达KDRQ472H细胞系的裸鼠皮下移植瘤生长速度比接种过表达KDRwt细胞的移植瘤生长速度要快。免疫组化结果KDRQ472H组移植瘤KDR均为高表达,而KDRwt组移植瘤的KDR均为低表达。3.不同浓度阿帕替尼作用于KDR野生型细胞系(KDRwt)和KDRQ472H细胞系,MTT法进行细胞增殖实验,测定阿帕替尼在各组细胞的IC50值。结果KDRwt组IC50值为（18.38±1.13）μmol/l,KDRQ472H组IC50值为（8.46±0.16）μmol/l。确定后续实验阿帕替尼作用浓度为15μmol/l。平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果示:阿帕替尼作用后,KDRQ472H组细胞克隆形成能力、细胞迁移能力及侵袭能力均明显下降,与KDRwt组比较,差异均具有统计学意义。体内动物实验结果:KDRwt组移植瘤,阿帕替尼作用后,抑瘤率为6.7%。而KDRQ472H组移植瘤经阿帕替尼作用后,生长速度明显减慢,阿帕替尼对该组的抑瘤率为53.2%。结论:1.在NEPC患者中,KDR突变的患者,KDR蛋白表达增高。而KDR蛋白高表达患者生存期短于低表达患者,是NEPC患者的独立预后因素。2.体外细胞实验证实KDRQ472H基因突变促进了人NEPC细胞的恶性生物学行为,使其增殖、迁移、侵袭能力增强。可能是通过激活MAPK通路发挥作用。KDRQ472H突变促进了神经内分泌型前列腺细胞在体内的增殖和生长。3.体内体外实验结果显示阿帕替尼对KDRQ472H基因突变后的NEPC作用更加敏感。我们有理由推测KDR基因可作为预测及治疗NEPC的一个极具潜力价值的新靶点,具有重要的应用前景。
徐天天[9]（2020）在《Revolution CT对高原红细胞增多症冠脉管径及心肌灌注的研究》文中提出目的:应用Revolution CT冠状动脉造影+心肌灌注（CCTA+CTP）一站式检查分析比较高海拔地区高原红细胞增多症（high altitude polycythemia,HAPC）患者与同海拔高度健康对照者冠脉管径大小和心肌灌注的异同,探讨高原低氧环境下HAPC患者冠脉管径及心肌灌注是否发生改变。方法:搜集2017年9月至2019年12月在我院明确诊断为HAPC的汉族男性患者及同海拔高度健康汉族男性对照者各31例。利用美国GE 256排Revolution CT对所有检查者进行一站式CCTA+CTP检查,检查前测量身高、体重,由计算机按公式自动计算出总造影剂剂量及注射速度,获取扫描原始图像并拆成0.625mm层厚传至aw4.6后处理工作站。经冠脉分析软件得出冠脉解剖图,分别测得左主干冠状动脉（left main coronary artery,LM）直径、右冠状动脉（Right coronary artery,RCA）直径,左回旋支动脉（Left circumflex coronary artery,LCX）直径、左前降支动脉（left anterior descending,LAD）直径。经灌注软件分析得出心脏灌注伪彩图,按照美国心脏病学会（AHA）推荐的左室17段标准分法（第17段即心尖段不纳入分析）,手动勾画分别测得16段心肌的BV、BF、MTT、TTP、PS灌注参数值。整理数据并统计分析比较高原红细胞增多症患者与同海拔高度健康检查者冠脉管径大小和心肌灌注值有无统计学差异。结果:1.HAPC患者红细胞、血红蛋白、红细胞压积大于健康对照者,血小板小于对照组,均具有统计学差异（P<0.05）。2.HAPC患者LM、LAD、LCX、RCA管径大于健康对照者,均具有统计学差异（P<0.05）。3.HAPC患者BF值低于健康对照者,BV、MTT、TTP、PS值高于健康对照者,均具有统计学差异（P<0.05）。结论:高原红细胞增多症患者为适应高原缺氧环境,冠脉管径及心肌灌注均发生改变,即冠脉管径代偿性增粗及心肌血流量减少,心脏处于低灌注状态,可能存在心肌缺血的风险。
刘婷婷[10]（2020）在《缺氧诱导因子-1α在甲基汞致PC12和BRL细胞毒性差异中的作用研究》文中提出背景与目的:甲基汞（MeHg）是一种普遍存在于环境中的污染物,虽然中枢神经系统是其主要的靶器官,但是对肝脏等非神经器官同样产生毒性损伤。HIF-1α作为低氧调节因子在机体缺血缺氧及化学性损伤应答中发挥着重要的细胞保护或细胞损伤作用。我们以PC12细胞作为神经元样细胞模型,以BRL细胞作为非神经细胞模型,探究神经元及非神经元细胞对MeHg毒性敏感性的差异,并进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在MeHg毒性中的作用,分析MeHg调控HIF-1α的可能机制。利用不同的方式分别从基因、蛋白方面调控HIF-1α,观察MeHg神经及肝损害效应的变化。一方面探究MeHg毒性机制与HIF-1α的关系,为MeHg中毒后所致的不同器官的损害提供诊断指标,同时评估上调HIF-1α对拮抗MeHg毒性效应的影响,研发针对不同MeHg毒性损害系统的有效拮抗剂。方法:1.根据前期的预实验,选择不同浓度的MeHg（0、1、2.5、5、10μM）分别处理PC12和BRL细胞不同时间（0、0.5、1、3、6 h）后,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测PC12及BRL细胞活力,评估其剂量-时间效应关系;利用乳酸脱氢酶漏出率（LDH）检测不同浓度（0、1、2.5、5、10μM）MeHg作用0.5 h后的细胞毒性作用;利用光学显微镜观察不同浓度MeHg作用后细胞形态学的变化;采用DCFH-DA荧光探针检测两株细胞中活性氧（ROS）随MeHg浓度改变后的改变情况,综合评价MeHg对PC12及BRL细胞的毒性作用及其差异。2.蛋白免疫印迹法（WB）用于检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,荧光定量PCR（RT-PCR）用于检测MeHg作用后HIF-1αmRNA水平的变化。探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用。利用药理学（2-MeOE2,10μM,0.5 h）抑制HIF-1α蛋白的表达,WB法检测蛋白变化,MTT法检测细胞活力进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在甲基汞致PC12及BRL细胞毒性中的作用。3.腺病毒过表达调控HIF-1α,WB法检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,MTT法检测细胞活力,以探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用,基因水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响。4.利用脯氨酸羟化酶抑制剂（DHB,1 mM,6 h）、（CoCl2,200μM,0.5 h）及蛋白酶体抑制剂（MG132,1μM,24 h）抑制HIF-1α的降解后,利用WB检测蛋白的变化,MTT检测细胞活力,一方面探讨从蛋白水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响,另一方面探讨MeHg调控HIF-1α的可能机制。结果:1.MTT结果表明,MeHg以剂量-时间依赖性的方式降低PC12及BRL细胞活力,PC12细胞中,MeHg浓度为5μM作用0.5 h后细胞活力下降具有统计学意义;在BRL细胞中,MeHg浓度为为10μM作用0.5 h后细胞活力显着下降;MeHg浓度为10μM作用0.5 h后,PC12和BRL细胞活力分别下降至68%和76%。LDH结果表明,在PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM时,LDH漏出率显着增高;而在BRL细胞中,MeHg浓度为10μM时,LDH漏出率明显升高。不同浓度MeHg作用0.5 h后两株细胞内的ROS的水平亦明显增高,同样浓度的MeHg处理后,在PC12细胞中,荧光强度强于BRL细胞中的荧光强度。2.WB结果表明不同浓度MeHg作用0.5 h后,在PC12和PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM和5μM时HIF-1α下降具有统计学意义。MeHg浓度为10μM作用0.5 h,HIF-1α蛋白表达下调至对照组的12%及54%。MeHg作用后对两株细胞的HIF-1β的水平无明显影响。MeHg亦以剂量依赖性方式下调两株细胞中HIF-1α的下游靶蛋白如GLUT-1、VEGF-A、EPO等。qRT-PCR结果表明,MeHg作用后对两株细胞的HIF-1αmRNA的水平亦无明显影响。利用2-MeOE2下调HIF-1α后能够进一步诱导MeHg所致的HIF-1α及其下游蛋白的表达下调并能加重因MeHg所致的细胞活力的下降,进一步论证HIF-1α参与甲基汞诱导的神经毒性和肝脏毒性损害。3.在基因水平上,利用腺病毒上调HIF-1α后,能够显着逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,拮抗MeHg所致的两株细胞毒性。4.在蛋白水平上,采用PHD抑制剂DHB、CoCl2预处理,可显着逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,CoCl2预处理可以明显拮抗MeHg所致的BRL细胞毒性损害,DHB预处理能够明显拮抗MeHg所致的两株细胞毒性损害,且拮抗MeHg所致的BRL细胞毒性更加明显。利用蛋白酶体抑制剂MG132预处理后亦能明显拮抗因MeHg所致HIF-1α及其下游蛋白的下调并明显拮抗MeHg的毒性,其中对MeHg所致的PC12细胞的毒性的拮抗作用更加明显。结论:神经元样细胞PC12细胞相对于大鼠肝BRL细胞对MeHg的毒性更加敏感。其机制可能与MeHg对HIF-1α及其下游靶蛋白（GLUT1、VEGF-A、EPO）的下调幅度不同有关。MeHg作用后不影响HIF-1α的转录水平而有可能是通过促进PHD依赖的蛋白酶体途径的降解。从基因水平和蛋白水平分别上调HIF-1α后可以拮抗MeHg所致的两株细胞的毒性,但拮抗效率不同,PHD抑制剂对拮抗MeHg致BRL的毒性效率要强于PC12细胞,蛋白酶体抑制剂对MeHg所致的PC12细胞的毒性的拮抗效率要强于BRL细胞。一方面提示HIF-1α可作为拮抗MeHg毒性的通用靶点,为HIF-1α作为血清学指标用于MeHg中毒的诊断提供新的方向,另一方面为选择针对不同系统的MeHg毒性的有效拮抗剂提供理论依据。
二、1997～2004年缺氧诱导因子文献统计分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、1997～2004年缺氧诱导因子文献统计分析（论文提纲范文）
（1）低氧诱导因子-1α调控心肌细胞自噬和凋亡与急性心肌梗死患者预后的关系及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:急性心肌梗死患者前瞻性队列研究一年及五年预后分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究流程图 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 研究对象的来源 |
| 2.2.2 病例的纳入及排除标准 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 基线调查方法 |
| 2.3.2 基线观察指标 |
| 2.3.3 随访方法 |
| 2.3.4 终点事件定义 |
| 2.3.5 相关概念定义 |
| 2.4 统计方法 |
| 2.5 主要研究变量的赋值说明 |
| 3 结果 |
| 3.1 基线资料及人口学特征 |
| 3.2 结局事件的发生率及分布情况 |
| 3.2.1 急性心肌梗死患者不同时期结局事件的发生率 |
| 3.2.2 按年龄分段急性心肌梗死患者人数及MACE分布 |
| 3.3 急性心肌梗死患者以一年MACE为结局事件的生存分析 |
| 3.3.1 一年MACE事件的单因素分析 |
| 3.3.2 一年MACE为结局的Kaplan-Meier生存曲线、Log-rank检验 |
| 3.3.3 一年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.3.4 一年MACE为结局的Cox多因素分析 |
| 3.4 急性心肌梗死患者以五年MACE为结局事件的生存分析 |
| 3.4.1 五年MACE事件的单因素分析 |
| 3.4.2 五年MACE为结局的Kaplan-Meier生存曲线、Log-rank检验 |
| 3.4.3 五年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.4.4 五年MACE为结局的Cox多因素分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:剩余Gensini评分评价动脉粥样硬化负担对急性心肌梗死患者预后的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究对象的来源 |
| 2.1.2 病例的纳入及排除标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 基线调查方法 |
| 2.2.2 基线观察指标 |
| 2.2.3 随访方法 |
| 2.2.4 终点事件定义 |
| 2.2.5 相关临床指标定义 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 高rGS 组和低rGS 组的基线特征及比较 |
| 3.1.1 高rGS 组和低rGS 组的基线特征 |
| 3.1.2 高rGS 组和低rGS 组的基线比较 |
| 3.2 高rGS 组和低rGS 组的结局事件比较 |
| 3.3 一年MACE为结局事件高rGS 组和低rGS 组的比较 |
| 3.3.1 一年是否发生MACE的 Gensini评分比较 |
| 3.3.2 一年MACE为结局的剩余Gensini评分Kaplan-Meier曲线 |
| 3.3.3 一年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.3.4 一年MACE为结局的Cox多因素分析 |
| 3.4 一年死亡为结局事件高rGS 组和低rGS 组的比较 |
| 3.4.1 一年是否发生死亡的Gensini评分比较 |
| 3.4.2 一年死亡为结局的剩余Gensini评分Kaplan-Meier曲线 |
| 3.4.3 一年死亡为结局的Cox单因素分析 |
| 3.4.4 一年死亡为结局的Cox多因素分析 |
| 3.5 五年MACE为结局高rGS 组和低rGS 组的比较 |
| 3.5.1 五年是否发生MACE的 Gensini评分比较 |
| 3.5.2 五年MACE为结局的剩余Gensini评分Kaplan-Meier曲线 |
| 3.5.3 五年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.5.4 五年MACE为结局的Cox多因素分析 |
| 3.6 五年死亡为结局事件高rGS 组和低rGS 组的比较 |
| 3.6.1 五年是否发生死亡的Gensini评分比较 |
| 3.6.2 五年死亡为结局的剩余Gensini评分Kaplan-Meier曲线 |
| 3.6.3 五年死亡为结局的Cox单因素分析 |
| 3.6.4 五年死亡为结局的Cox多因素分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:血清HIF-1α、Bcl-2、Beclin-1 与急性心肌梗死患者预后的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究对象的来源 |
| 2.1.2 病例的纳入及排除标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 调查方法 |
| 2.2.2 血样采集 |
| 2.2.3 检测HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 生物标记物 |
| 2.2.4 数据计算 |
| 2.2.5 终点事件定义 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 急性心肌梗死患者基线血清HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度 |
| 3.1.1 基线血清HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 标准曲线 |
| 3.1.2 基线血清HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度 |
| 3.2 一年MACE为结局事件HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.2.1 一年是否发生MACE分组HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.2.2 一年MACE为结局HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度Kaplan-Meier曲线 |
| 3.2.3 一年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.2.4 一年MACE为结局的Cox多因素回归分析 |
| 3.3 一年死亡为结局事件HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.3.1 一年是否发生死亡分组HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.3.2 一年死亡为结局的HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度Kaplan-Meier曲线 |
| 3.4 五年MACE为结局事件HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.4.1 五年是否发生MACE分组HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.4.2 五年MACE为结局HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度Kaplan-Meier曲线 |
| 3.4.3 五年MACE为结局的Cox单因素分析 |
| 3.4.4 五年MACE为结局的Cox多因素分析 |
| 3.5 五年死亡为结局事件HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.5.1 五年是否发生死亡分组HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度比较 |
| 3.5.2 五年死亡为结局的HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2 浓度Kaplan-Meier曲线 |
| 3.5.3 五年死亡为结局的Cox单因素分析 |
| 3.5.4 五年死亡为结局的Cox多因素分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分:HIF-1α在缺氧状态下调节心肌细胞凋亡与自噬的机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 H9C2 心肌细胞培养 |
| 2.2.2 构建关于大鼠HIF-1α沉默H9C2 细胞 |
| 2.2.3 H9C2 细胞过表达模型构建 |
| 2.2.4 心肌细胞缺氧模型的建立 |
| 2.2.5 实验分组 |
| 2.2.6 Western Blot蛋白印记方法检测细胞蛋白量表达 |
| 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 H2C9 心肌细胞HIF-1α蛋白表达情况 |
| 3.2 H2C9 心肌细胞BNIP3 蛋白表达情况 |
| 3.3 H2C9 心肌细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3 以及p62 蛋白表达情况 |
| 3.4 H2C9 心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及Caspase-3 蛋白表达情况 |
| 3.5 HIF-1α表达与BNIP3、自噬、凋亡蛋白表达的相关性。 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 HIF-1 调控缺氧状态下心肌细胞自噬和凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）体外冲击波联合超短波疗法对固定诱导的骨骼肌纤维化和挛缩的影响及可能机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 体外冲击波疗法在骨骼肌肉系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）低氧诱导人肝癌细胞差异表达基因分析及SLC6A8基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 急性低氧处理诱导人肝癌系差异基因表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞系和处理方法 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 芯片信息 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 RNA提取和质量检测 |
| 1.2.2 芯片检测 |
| 1.2.3 差异表达基因的富集分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 样本总RNA数量和质量保证检测结果 |
| 2.2 差异表达基因的筛选 |
| 2.3 差异表达基因的GO功能富集分析 |
| 2.4 差异表达基因的KEGG信号通路富集分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 慢病毒介导的SLC6A8基因沉默对人肝癌细胞增殖侵袭能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.1.1 主要试剂及耗材 |
| 1.1.2 主要耗材 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Huh-7和Hep3B细胞培养 |
| 1.2.2 Huh-7和Hep3B细胞转染慢病毒 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.2.4 Western blot检测SLC6A8和HIF1α表达 |
| 1.2.5 MTT检测细胞增殖 |
| 1.2.6 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.2.8 Transwell检测细胞侵袭能力 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SLC6A8 siRNA重组慢病毒成功转染Huh-7和Hep3B细胞 |
| 2.2 荧光定量PCR检测SLC6A8 m RNA在肝癌细胞系中的表达 |
| 2.3 Western blot检测SLC6A8和HIF-1α表达量 |
| 2.4 沉默SLC6A8对肝癌细胞系增殖的影响 |
| 2.5 沉默SLC6A8对肝癌细胞系凋亡的影响 |
| 2.6 沉默SLC6A8对肝癌细胞系迁移的影响 |
| 2.7 沉默SLC6A8对肝癌细胞系侵袭能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肿瘤缺氧微环境 |
| 3.2 低氧诱导的信号通路 |
| 3.3 SLC6A8对癌症的调控作用 |
| 3.4 SLC6A8与HIF-1α的调控关系 |
| 不足和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 低氧在肝癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及获得的科研成果 |
（4）Ngb和HIF-1α在牦牛与黄牛不同脑组织表达与分布的比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 主要缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 研究背景概述 |
| 1.1 高原动物的生理特征 |
| 1.2 脑与缺氧之间的联系 |
| 1.3 牦牛适应高原环境的探究 |
| 2 脑红蛋白研究进展 |
| 2.1 脑红蛋白概述 |
| 2.2 脑红蛋白结构特点 |
| 2.3 脑红蛋白在脑组织中的分布特征 |
| 2.4 脑红蛋白对脑组织的生物学意义 |
| 3 缺氧诱导因子-1研究进展 |
| 3.1 缺氧诱导因子-1概述 |
| 3.2 缺氧诱导因子-1结构特点 |
| 3.3 缺氧诱导因子-1生理功能 |
| 3.4 缺氧诱导因子-1与脑红蛋白之间的联系 |
| 4 哺乳动物脑组织分区及其主要功能的研究进展 |
| 4.1 哺乳动物脑组织分区概述 |
| 4.2 脑组织各区域功能特征 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 Ngb和 HIF-1α在牦牛与黄牛端脑不同区域表达与分布的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牦牛与黄牛端脑不同区域Ngb和 HIF-1αmRNA qRT-PCR检测 |
| 1.2.2 牦牛与黄牛端脑不同区域Ngb和 HIF-1α蛋白Western blot检测 |
| 1.2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白免疫组织化学染色定位 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ngb mRNA和蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达 |
| 2.2 HIF-1αmRNA和蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的表达 |
| 2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白在牦牛与黄牛端脑不同区域的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 实验二 Ngb和 HIF-1α在牦牛与黄牛间脑不同区域表达与分布的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牦牛与黄牛间脑不同区域Ngb和 HIF-1αmRNA qRT-PCR检测 |
| 1.2.2 牦牛与黄牛间脑不同区域Ngb和 HIF-1α蛋白Western blot检测 |
| 1.2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白免疫组织化学染色定位 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ngb mRNA和蛋白在牦牛与黄牛间脑不同区域的表达 |
| 2.2 HIF-1αmRNA和蛋白在牦牛与黄牛间脑不同区域的表达 |
| 2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白在牦牛与黄牛间脑不同区域的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 实验三 Ngb和 HIF-1α在牦牛与黄牛菱脑不同区域表达与分布的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牦牛与黄牛菱脑不同区域Ngb和 HIF-1αmRNA qRT-PCR检测 |
| 1.2.2 牦牛与黄牛菱脑不同区域Ngb和 HIF-1α蛋白Western blot检测 |
| 1.2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白免疫组织化学染色定位 |
| 1.2.4 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ngb mRNA和蛋白在牦牛与黄牛菱脑不同区域的表达 |
| 2.2 HIF-1αmRNA和蛋白在牦牛和黄牛菱脑不同区域的表达 |
| 2.3 Ngb和 HIF-1α蛋白在牦牛与黄牛菱脑不同区域的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（5）线粒体通路信号介导细胞凋亡机制及对宰后牛肉嫩化影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述及立题依据 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 细胞凋亡概述 |
| 1.2.1.1 细胞凋亡的概念及其形成 |
| 1.2.1.2 细胞凋亡发生的途径 |
| 1.2.1.3 畜禽骨骼肌宰后成熟过程发生线粒体途径细胞凋亡 |
| 1.2.2 线粒体蛋白Cyt-c介导(非)Caspase依赖性细胞凋亡 |
| 1.2.3 线粒体蛋白AIF介导非Caspase依赖性细胞凋亡 |
| 1.2.3.1 AIF及其凋亡诱导活性 |
| 1.2.3.2 影响AIF发挥凋亡效应的信号分子 |
| 1.2.3.3 AIF与 Caspase途径的关系 |
| 1.2.4 溶酶体及溶酶体酶参与线粒体途径细胞凋亡机制 |
| 1.2.4.1 溶酶体膜通透性与细胞凋亡 |
| 1.2.4.2 溶酶体组织蛋白酶与细胞凋亡 |
| 1.2.4.3 溶酶体-线粒体途径介导细胞凋亡机制 |
| 1.2.5 线粒体细胞凋亡对宰后骨骼肌嫩化的影响 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 线粒体Cyt-c介导牛肉成熟过程凋亡的发生及对肌肉嫩度的影响 |
| 2.1 试验材料与试剂设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试剂与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样本采集与处理 |
| 2.2.2 免疫印迹蛋白样品的提取 |
| 2.2.3 SDS-PAGE和 Western blotting免疫印迹分析 |
| 2.2.4 Cyt-c结构测定 |
| 2.2.4.1 Cyt-c粗品的制备 |
| 2.2.4.2 Cyt-c纯化 |
| 2.2.4.3 Cyt-c纯品鉴定 |
| 2.2.4.4 Cyt-c结构测定 |
| 2.2.5 Caspase-9和Caspase-3 活性测定 |
| 2.2.6 细胞凋亡率测定 |
| 2.2.7 pH值测定 |
| 2.2.8 线粒体膜通透性测定 |
| 2.2.9 肌原纤维小片化指数(MFI)测定 |
| 2.2.10 剪切力测定 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 牛肉宰后成熟过程中Cyt-c从线粒体释放到胞浆 |
| 2.3.2 牛肉宰后成熟过程中Cyt-c结构变化 |
| 2.3.3 牛肉宰后成熟过程中Caspases活性变化 |
| 2.3.4 牛肉宰后成熟过程中Caspase-3 被激活 |
| 2.3.5 牛肉宰后成熟过程中细胞凋亡率变化 |
| 2.3.6 牛肉宰后成熟过程中pH及线粒体膜通透性变化 |
| 2.3.7 Cyt-c结构与细胞凋亡率相关性分析 |
| 2.3.8 牛肉宰后成熟过程中Caspase活化对肌肉嫩度的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 线粒体Cyt-c介导牛肉宰后成熟过程Caspase活化及凋亡的发生 |
| 2.4.2 pH和线粒体膜通透性变化是Cyt-c释放的必要条件 |
| 2.4.3 Cyt-c介导牛肉宰后成熟过程凋亡发生对肌肉嫩度的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 线粒体AIF介导牛肉成熟过程凋亡的发生及对肌肉嫩度的影响 |
| 3.1 试验材料与试剂设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试剂与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 样本采集与处理 |
| 3.2.2 免疫印迹蛋白样品的提取 |
| 3.2.3 SDS-PAGE和 Western blotting免疫印迹分析 |
| 3.2.4 苏木精-伊红(HE)细胞核染色 |
| 3.2.5 线粒体肿胀测定 |
| 3.2.6 活性氧(ROS)含量测定 |
| 3.2.7 线粒体Ca~(2+)浓度测定 |
| 3.2.8 钙蛋白酶活性测定 |
| 3.2.9 组织蛋白酶活性测定 |
| 3.2.10 MFI测定 |
| 3.2.11 剪切力测定 |
| 3.2.12 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 牛肉宰后成熟过程中AIF表达的变化 |
| 3.3.2 牛肉宰后成熟过程中细胞核凋亡变化 |
| 3.3.3 牛肉宰后成熟过程中线粒体肿胀变化 |
| 3.3.4 牛肉宰后成熟过程中ROS含量及Ca~(2+)浓度变化 |
| 3.3.5 牛肉宰后成熟过程中钙蛋白酶活性变化 |
| 3.3.6 牛肉宰后成熟过程中组织蛋白酶活性变化 |
| 3.3.7 牛肉宰后成熟过程中AIF活化对肌肉嫩度的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AIF介导牛肉宰后成熟过程中Caspase依赖性细胞核凋亡 |
| 3.4.2 牛肉宰后成熟过程中影响AIF释放的因素 |
| 3.4.3 AIF介导Caspase依赖性细胞凋亡对肌肉嫩度的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 溶酶体-线粒体途径介导牛肉成熟过程凋亡的发生及对肌肉嫩度的影响 |
| 4.1 试验材料与试剂设备 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂与设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样本采集与处理 |
| 4.2.2 溶酶体膜稳定性测定 |
| 4.2.3 线粒体蛋白的提取 |
| 4.2.4 ROS含量测定 |
| 4.2.5 谷胱甘肽(GSH)活性测定 |
| 4.2.6 组织蛋白酶活性测定 |
| 4.2.7 免疫印迹蛋白样品的提取 |
| 4.2.8 SDS-PAGE和 Western blotting免疫印迹分析 |
| 4.2.9 线粒体膜通透性测定 |
| 4.2.10 Caspase-9和Caspase-3 酶活性测定 |
| 4.2.11 剪切力测定 |
| 4.2.12 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 牛肉宰后成熟过程中溶酶体膜稳定性变化 |
| 4.3.2 牛肉宰后成熟过程中ROS含量及GSH活性变化 |
| 4.3.3 牛肉宰后成熟过程中组织蛋白酶活性变化 |
| 4.3.4 牛肉宰后成熟过程中Bid及 Bax表达变化 |
| 4.3.5 牛肉宰后成熟过程中线粒体膜通透性变化 |
| 4.3.6 牛肉宰后成熟过程中Caspase活性变化 |
| 4.3.7 溶酶体-线粒体凋亡途径激活对肌肉嫩度的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 溶酶体铁诱导牛肉宰后成熟过程中溶酶体膜失稳和组织蛋白酶释放 |
| 4.4.2 溶酶体组织蛋白酶D介导牛肉宰后成熟过程中线粒体凋亡途径发生 |
| 4.4.3 溶酶体-线粒体凋亡途径的激活对肌肉嫩度的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 溶酶体Fe介导牛肉宰后成熟过程线粒体凋亡途径的发生及对蛋白降解的影响 |
| 5.1 试验材料与试剂设备 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试剂与设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 样本采集与处理 |
| 5.2.2 线粒体蛋白的提取 |
| 5.2.3 线粒体膜通透性测定 |
| 5.2.4 线粒体膜电位测定 |
| 5.2.5 线粒体Ca~(2+)浓度测定 |
| 5.2.6 Cyt-c氧化还原状态测定 |
| 5.2.7 免疫印迹全蛋白样品的提取 |
| 5.2.8 SDS-PAGE和 Western blotting免疫印迹分析 |
| 5.2.9 Caspase-9和Caspase-3 酶活性测定 |
| 5.2.10 统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 牛肉宰后成熟过程中线粒体膜通透性和膜电位变化 |
| 5.3.2 牛肉宰后成熟过程中Ca~(2+)浓度和Cyt-c氧化还原状态变化 |
| 5.3.3 牛肉宰后成熟过程中Cyt-c和 Bid蛋白表达变化 |
| 5.3.4 牛肉宰后成熟过程中Caspase活性变化 |
| 5.3.5 牛肉宰后成熟过程中Desmin和 Troponin-T蛋白降解变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 溶酶体Fe诱导线粒体膜损伤并引发Ca~(2+)积累和Cyt-c氧化还原状态改变 |
| 5.4.2 溶酶体Fe激活Cyt-c和 Bid蛋白并改变Caspase活性 |
| 5.4.3 溶酶体Fe参与线粒体凋亡途径对宰后肌肉蛋白降解的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 肌肉特异性线粒体细胞凋亡对牛肉宰后成熟过程中蛋白降解的影响 |
| 6.1 试验材料与仪器设备 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试剂与设备 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 样本采集与处理 |
| 6.2.2 线粒体蛋白的提取 |
| 6.2.3 线粒体膜通透性测定 |
| 6.2.4 线粒体脂质过氧化测定 |
| 6.2.5 线粒体Ca~(2+)浓度测定 |
| 6.2.6 Cyt-c氧化还原状态测定 |
| 6.2.7 Caspase-9和Caspase-3 酶活性测定 |
| 6.2.8 免疫印迹全蛋白样品的提取 |
| 6.2.9 SDS-PAGE和 Western blotting免疫印迹分析 |
| 6.2.10 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 不同部位牛肉宰后成熟过程中线粒体膜通透性和线粒体脂质过氧化变化 |
| 6.3.2 不同部位牛肉宰后成熟过程中Cyt-c表达和Caspase活性变化 |
| 6.3.3 不同部位牛肉宰后成熟过程中Ca~(2+)浓度和Cyt-c氧化还原状态变化 |
| 6.3.4 不同部位牛肉宰后成熟过程中Desmin和 Troponin-T蛋白降解变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 牛肉不同肌肉类型在宰后成熟过程中发生线粒体途径细胞凋亡 |
| 6.4.2 肌肉特异性线粒体细胞凋亡对牛肉宰后成熟过程中蛋白降解的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 全文总结及展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 特色与创新之处 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（6）双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 主要试剂及仪器 |
| 绪论和引言 |
| 绪论 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 血管瘤 |
| 2 血管瘤的生物学 |
| 3 双酚S |
| 4 双酚S在血管瘤细胞中诱导EMT |
| 5 双酚S通过bFGF的上调触发血管瘤细胞的增殖及其细胞周期的转变 |
| 6 血管瘤治疗 |
| 7 血管生成信号通路间的联系 |
| 8 总结和展望 |
| 第1章 双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子诱发血管瘤细胞恶性变 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 细胞培养与处理 |
| 1.1.2 细胞增殖测定 |
| 1.1.3 细胞集落形成试验 |
| 1.1.4 细胞周期分析 |
| 1.1.5 实时RT-PCR分析 |
| 1.1.6 蛋白质印迹分析 |
| 1.1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.1.8 启动子活性分析 |
| 1.1.9 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BPS诱导HA细胞的增殖和细胞周期转变 |
| 1.2.2 BPS增加HA细胞bFGF的表达 |
| 1.2.3 bFGF参与BPS诱导的HA细胞增殖 |
| 1.2.4 BPS可以增加bFGF的转录和m RNA稳定性 |
| 1.2.5 NF-κB参与BPS诱导的HA细胞bFGF表达 |
| 1.2.6 miR-155-5p参与BPS增强bFGF mRNA稳定性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 BPS通过增加HA细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达增加HA细胞增殖和迁移的机制 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞及细胞处理 |
| 2.1.2 细胞转染及抑制剂 |
| 2.1.3 实验分组 |
| 2.1.4 逆转录定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.1.5 蛋白质免疫印迹 |
| 2.1.6 细胞增殖测定 |
| 2.1.7 细胞凋亡分析 |
| 2.1.8 细胞迁移试验 |
| 2.1.9 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 BPS诱导bFGF、VEGF、FGFR1 表达 |
| 2.2.2 BPS诱导细胞增殖 |
| 2.2.3 细胞凋亡及活力检测 |
| 2.2.4 BPS促进血管瘤细胞的迁移侵袭 |
| 2.2.5 NF-κB参与BPS诱导的细胞中bFGF的表达 |
| 2.2.6 蛋白印迹分析bFGF/ FGFR1 含量 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 BPS通过激活和增加缺氧诱导因子(HIF)-1α增加b FGF表达的分子机制 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 细胞处理及siRNA |
| 3.1.3 实验分组 |
| 3.1.4 蛋白质免疫印迹 |
| 3.1.5 MTT检测细胞增殖 |
| 3.1.6 TUNEL分析 |
| 3.1.7 逆转录定量PCR(RT-qPCR) |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 BPS以剂量浓度方式促进血管瘤细胞中HIF-1α及 bFGF蛋白表达 |
| 3.2.2 BPS以时间依赖性方式促进血管瘤细胞中HIF-1α及 bFGF蛋白表达 |
| 3.2.3 BPS促进血管瘤细胞增殖 |
| 3.2.4 TUNEL染色分析 |
| 3.2.5 BPS通过激活HIF-1α增加bFGF的表达 |
| 3.2.6 BPS促进血管瘤细胞中STAT3和Bcl-2 的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 BPS通过上调HIF-1α和下调miR-195 来增加bFGF的表达来触发HA细胞的恶性发展的机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BPS下调miR-195 和上调bFGF水平 |
| 4.2.2 miR-195 模拟物抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 |
| 4.2.3 miR-195 抑制剂促进增殖并阻止细胞凋亡 |
| 4.2.4 HIF-1α被确定为miR-195 的直接靶标 |
| 4.2.5 miR-195 调控HIF-1α和 b FGF水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点及不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤 |
| 1.1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤现状 |
| 1.1.2 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤机制 |
| 1.2 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路 |
| 1.2.1 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路的发现 |
| 1.2.2 氧平衡与低氧 |
| 1.2.3 低氧诱导因子 |
| 1.2.4 低氧诱导因子脯氨酰羟化酶 |
| 1.2.5 靶向PHD抑制剂的应用 |
| 1.3 胞内抗体 |
| 1.3.1 胞内抗体的概述 |
| 1.3.2 胞内抗体的分类 |
| 1.3.3 胞内抗体的优势和应用 |
| 1.4 本研究的立题目的和研究内容 |
| 第2章 靶向PHD2 胞内抗体的构建和活性表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 成功制备靶向PHD2 胞内抗体ER-INP |
| 2.3.2 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP在细胞中的表达及定位 |
| 2.3.3 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP的生物学活性 |
| 2.3.4 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP不影响细胞形态和生存率 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 靶向PHD2 胞内抗体体内和体外的促血管生成效应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 靶向PHD2 胞内抗体在体内外有效促进血管生成 |
| 3.3.2 靶向PHD2 胞内抗体显着上调HIF-1 下游靶基因 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 靶向PHD2 胞内抗体保护APAP诱导的肝损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 建立了APAP诱导的肝损伤动物模型 |
| 4.3.2 小鼠尾静脉注射GFP质粒靶向富集肝脏 |
| 4.3.3 ER-INP能在小鼠肝脏表达,但不影响正常肝脏组织形态和酶学特征 |
| 4.3.4 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 靶向PHD2胞内抗体有效促进APAP诱导肝损伤小鼠肝脏血管生成 |
| 5.3.2 靶向PHD2 胞内抗体对肝损伤小鼠体内细胞应激的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 靶向PHD2 胞内抗体的制备及其促血管生成效应 |
| 6.2 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用及机制 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）KDR突变在神经内分泌型前列腺癌中的作用及对KDR抑制剂疗效的预测作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、NEPC中 KDR突变对KDR蛋白表达的影响和临床意义 |
| 1.1 研究对象和方法 |
| 1.1.1 组织标本来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 免疫组织化学染色分析原理及步骤 |
| 1.1.5 免疫组化结果判定标准 |
| 1.1.6 Gleason评分 |
| 1.1.7 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 KDR突变对KDR蛋白表达的影响及意义 |
| 1.2.2 NEPC患者的临床病理学特征分析 |
| 1.2.3 NEPC中 KDR蛋白高表达对于患者的预后意义 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、KDR突变在NEPC发展中的作用的实验研究 |
| 2.1 体外细胞实验研究对象和实验方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂、试剂盒 |
| 2.1.4 相关实验溶液的配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 体内动物实验研究对象和实验方法 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 主要实验材料和试剂 |
| 2.2.3 方法和步骤 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 稳定过表达KDRQ472H、KDRwt的NEPC细胞株成功建立 |
| 2.4.2 MTT实验验证KDRQ472H突变后对PC3 细胞增殖能力的影响 |
| 2.4.3 细胞划痕实验验证KDR突变对PC3细胞迁移能力的改变 |
| 2.4.4 KDR突变对PC3细胞克隆形成能力的影响 |
| 2.4.5 Transwell实验检验KDR突变后PC3 细胞侵袭能力的改变 |
| 2.4.6 KDR突变后促进PC3细胞恶性生物学行为可能涉及的信号通路 |
| 2.4.7 体内动物实验的结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 KDR在肿瘤发展中的作用 |
| 2.5.2 NEPC细胞株的选择 |
| 2.5.3 KDR突变在神经内分泌前列腺癌中发生发展的作用机制初探 |
| 2.6 小结 |
| 三、VEGFR-TKI(阿帕替尼)对KDR突变型及野生型NEPC的抑制作用 |
| 3.1 体外细胞实验研究 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要实验试剂仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 体内动物实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同浓度的阿帕替尼单药对各组细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 平板克隆实验验证Apatinib对 PC3 细胞突变后增殖活性的影响 |
| 3.3.3 Apatinib对 PC3 细胞KDR突变后迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.3.4 阿帕替尼干预后各组裸鼠移植瘤生长速度的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 阿帕替尼在晚期肿瘤中的作用 |
| 3.4.2 阿帕替尼在神经内分泌型前列腺癌中的作用 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 神经内分泌型前列腺癌的生物学研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Revolution CT对高原红细胞增多症冠脉管径及心肌灌注的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 一般资料 |
| 2.1.2 纳入及排除标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 检查设备 |
| 2.2.2 扫描方法 |
| 2.2.3 图像处理 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 两组之间一般资料的比较 |
| 3.2 两组之间RBC、HCT、Hb、PLT的比较 |
| 3.3 两组之间RCA、LM、LAD、LCX的比较 |
| 3.4 两组之间BF、BV、MTT、TTP、PS的比较 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 HAPC发病机制、血液构成改变 |
| 4.2 低氧对肺循环的影响 |
| 4.2.1 HPAH的发病机制 |
| 4.2.2 HPAH的诊断标准 |
| 4.3 本研究心脏冠脉形态改变探讨 |
| 4.4 本研究心肌灌注改变探讨 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 科研成果简介 |
| 致谢 |
| 附录A 附图 |
| 附录B 综述 高原红细胞增多症心脏损害机制及影像研究进展 |
| 参考文献 |
（10）缺氧诱导因子-1α在甲基汞致PC12和BRL细胞毒性差异中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甲基汞(MeHg) |
| 1.1.1 MeHg概述 |
| 1.1.2 MeHg对不同系统的损伤作用 |
| 1.1.3 MeHg的毒性机制 |
| 1.2 HIF-1α |
| 1.2.1 HIF-1α的调控及功能特点 |
| 1.2.2 HIF-1α与脑损伤 |
| 1.2.3 HIF-1α与肝损伤 |
| 1.2.4 HIF-1α与肺损伤 |
| 1.2.5 HIF-1α与肾损伤 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.3.1 研究背景 |
| 1.3.2 研究价值与意义 |
| 1.3.3 实验设计方案 |
| 第二章 MeHg对 PC12及BRL细胞的毒性作用及其差异 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验室常用的试剂及相应配制方法 |
| 2.1.4 实验药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PC12和BRL细胞的培养 |
| 2.2.2 MTT法检测细胞活力 |
| 2.2.3 LDH漏出率检测细胞毒性 |
| 2.2.4 细胞ROS荧光实验 |
| 2.2.5 普通光学显微镜法观察细胞形态变化 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 MeHg对 PC12及BRL细胞的细胞活力的影响 |
| 2.3.2 MeHg对 PC12及BRL细胞的细胞毒性的影响 |
| 2.3.3 MeHg对 PC12及BRL细胞形态学的影响 |
| 2.3.4 MeHg对 PC12及BRL细胞中ROS的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HIF-1α及其下游蛋白在MeHg致 PC12和BRL细胞毒性中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 实验器材 |
| 3.1.3 实验室常用试剂及配置方法 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.2 实验操作 |
| 3.2.1 蛋白质提取的方法与步骤 |
| 3.2.2 蛋白质定量的检测 |
| 3.2.3 蛋白质免疫印迹法 |
| 3.2.4 Quantitative real-time PCR技术检测细胞HIF-1α的 m RNA转录水平 |
| 3.2.5 2-MeOE2 预处理抑制HIF-1α蛋白的表达下调HIF-1α |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 MeHg对 HIF-1αmRNA的影响 |
| 3.3.2 MeHg对 HIF-1α及 HIF-1β蛋白的影响 |
| 3.3.3 MeHg对 HIF-1α下游蛋白的影响 |
| 3.3.4 HIF-1α抑制剂2-MeOE2 预处理后对MeHg诱导的PC12及BRL细胞急性损伤的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 腺病毒过表达HIF-1α对 MeHg所致的PC12和BRL细胞急性损伤的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂及配置 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.2 实验操作 |
| 4.2.1 腺病毒转染过表达HIF-1α实验 |
| 4.2.2 腺病毒预处理过表达HIF-1α |
| 4.2.3 Western blotting检测各种药物预处理后HIF-1α及其下游靶蛋白的表达情况 |
| 4.2.4 MTT检测各种药物预处理后细胞活力的变化 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 腺病毒滴度的筛选 |
| 4.3.2 腺病毒过表达HIF-1α对 MeHg诱导的PC12及BRL细胞急性损伤的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 在蛋白水平上调控HIF-1α蛋白水平对MeHg所致的PC12和BRL细胞急性损伤的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验对象 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂及配置 |
| 5.1.4 实验试剂 |
| 5.2 实验操作 |
| 5.2.1 CoCl2和DHB预处理抑制PHD的活性上调HIF-1α |
| 5.2.2 MG132 预处理抑制蛋白酶体的活性上调HIF-1α |
| 5.2.3 Western blotting检测各种药物预处理后HIF-1α及其下游靶蛋白的表达情况 |
| 5.2.4 MTT检测各种药物预处理后细胞活力的变化 |
| 5.2.5 数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 HIF-1α激活剂CoCl_2预处理后对MeHg诱导的PC12及BRL细胞急性损伤的影响 |
| 5.3.2 PHD抑制剂DHB对 MeHg诱导的细胞急性损伤的影响 |
| 5.3.3 蛋白酶体抑制剂MG132对MeHg诱导的细胞急性损伤的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文及参加的学术会议 |
四、1997～2004年缺氧诱导因子文献统计分析（论文参考文献）
- [1]低氧诱导因子-1α调控心肌细胞自噬和凋亡与急性心肌梗死患者预后的关系及机制研究[D]. 张晓红. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]体外冲击波联合超短波疗法对固定诱导的骨骼肌纤维化和挛缩的影响及可能机制[D]. 黄鹏鹏. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]低氧诱导人肝癌细胞差异表达基因分析及SLC6A8基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响[D]. 路远. 右江民族医学院, 2020(03)
- [4]Ngb和HIF-1α在牦牛与黄牛不同脑组织表达与分布的比较研究[D]. 米晓钰. 甘肃农业大学, 2020
- [5]线粒体通路信号介导细胞凋亡机制及对宰后牛肉嫩化影响[D]. 张佳莹. 甘肃农业大学, 2020
- [6]双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制[D]. 刘大海. 吉林大学, 2020(08)
- [7]靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究[D]. 赵良中. 吉林大学, 2020(08)
- [8]KDR突变在神经内分泌型前列腺癌中的作用及对KDR抑制剂疗效的预测作用[D]. 陈艳芳. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]Revolution CT对高原红细胞增多症冠脉管径及心肌灌注的研究[D]. 徐天天. 青海大学, 2020(02)
- [10]缺氧诱导因子-1α在甲基汞致PC12和BRL细胞毒性差异中的作用研究[D]. 刘婷婷. 江苏大学, 2020(02)