一、经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病（论文文献综述）
王超[1]（2020）在《水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用》文中研究表明第一部分水母（Jellyfish）属刺胞动物门,是海洋中一类分布广泛、生物总量庞大的无脊椎动物。水母毒素是多肽/蛋白类混合物,主要储存于触手上的一类特化细胞器——刺丝囊（nematocyst）中。由于水母种类、地域分布及捕食对象的不同,其毒素的组成、生物活性也存在一定的差异。为了更好地研究和比较不同种属水母刺丝囊毒性组分的差异,本论文的第一部分以我国近海大规模暴发的发形霞水母（Cyanea capillata,C.capillata）和越前水母（Nemopilema nomurai,N.nomurai）为研究对象,首先构建高质量的水母触手转录组数据库;其次优化这两种水母最主要的捕食性刺丝囊纯化以及毒素提取的方法,进一步利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass chromatography,LC-MS/MS）组学方法对两种水母刺丝囊毒素的蛋白组成进行比较分析。主要结果如下:1.本课题组前期已成功构建C.capillata触手组织cDNA文库,此次利用RNA-seq和de novo组装,基于Illumina Hi SeqTM 2000平台成功构建了N.nomurai触手组织转录组,得到118,243条有效Unigenes序列。使用Blastx算法将组装好的unigenes 与公共数据库（Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO 和 KEGG）进行比对,其中15,927个unigenes得到同源注释。在KOG注释中,25,733个unigenes被分为25个功能类别。GO注释中,26,933个unigenes根据生物学进程、细胞成分和分子功能进行了注释和分组。KEGG注释中,有19,423个unigenes富集于包括机体系统、代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程等不同的功能类别中。2.采用优化后的方法从C.capillata和N.nomurai分离纯化到了两种主要的捕食性刺丝囊,利用光镜和扫描电镜观察其形态学差异,结果发现来自C.capillata的主要是isorhiza型刺丝囊,而来自N.nomurai的主要是mastigophore型刺丝囊。聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析刺丝囊内毒素蛋白条带的差异,显示N.nomurai刺丝囊毒素（Nemopilema nomurai nematocyst venom,NnV）中大分子量蛋白（>40 kDa）较C.capillata刺丝囊毒素（Cyanea capillata nematocyst venom,CnV）更多,且 NnV 的蛋白分子量范围更广。CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测两种刺丝囊毒素的毒性差异并计算IC50值,结果表明NnV的细胞毒性约为CnV的5倍。3.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳-液相色谱-电喷雾质谱（Liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry,LC-ESI/MS）联用 的方式,获得 CnV和NnV蛋白组分的初始肽段,在CnV和NnV中分别产生了 189,309和267,286个MS/MS肽段。肽段匹配数据库分别为:C.capillata和N.nomurai触手转录组数据（自建）、Uniprot 动物毒素数据库（Uniprot animal toxin and venom database）、Uniprot分类学刺胞动物门数据库以及通过文献查找的其它已报道的生物毒素信息。通过检索匹配,最终在CnV和NnV中分别鉴定和注释到345和329个蛋白,其中结构蛋白、酶和毒素类蛋白数量最多。经过进一步分析,最终在CnV和NnV中分别鉴定出53和69个毒素相关蛋白。这些毒素亦常见于其他有毒动物,包括一些刺胞动物（Nematostella vectensis,Hydra vulgaris）)、蛇（Gloydius ussuriensis,Naja annulifera）、蜘蛛（Loxosceles intermedia、Lycosa singoriensis）、蝎子（Mesobuthus martensii、Lychas mucronatus）等。4.比较分析后可以将CnV和NnV中共有的蜇伤中毒相关的毒素蛋白大致分为10类:蛋白酶类、磷脂酶、神经毒素、cysteine-rich分泌性蛋白、凝集素、孔道形成毒素、蛋白酶抑制剂、离子通道抑制剂、杀虫活性成分和其他毒素。以上毒素在CnV和NnV之间的构成比例存在明显差异。例如,NnV占比最高的三类毒素是金属蛋白酶、蛋白酶类以及孔道形成毒素,分别占NnV毒素的27.5%、18.8%和8.7%。CnV中最多的三类毒素分别为磷脂酶、神经毒素和蛋白酶类,分别占22.6%、17.0%和 11.3%。该部分结果揭示了我国两种常见的暴发性水母刺丝囊毒素分子的多样性,同时还提示不同水母刺丝囊毒素组分构成比例的不同与其蜇伤效应间可能存在的关系,有望为不同水母蜇伤的治疗提供指导。第二部分在多组学分析结果的指导下,本课题组致力于水母毒素的分离纯化及生物学活性研究。在前期分离纯化过程中,我们发现水母刺丝囊粗毒组分疏水性强、稳定性差（对热不稳定、pH变化敏感）,目前全球也仅有少数几种毒素分子被成功分离、鉴定。但是本课题组在分离纯化NnV的过程中发现了一个有趣现象:从刺丝囊提取的粗毒具有高水溶性,而将粗毒水溶液置于截留分子量为10 kDa的透析袋中,在纯水中透析24 h后发现透析袋内有沉淀产生,即毒素的水溶性明显降低;若将粗毒样品直接进行离子交换、凝胶过滤分离,则发现第一个蛋白洗脱峰均为紫外吸收明显的大峰,而之后的洗脱峰紫外吸收很低。表明刺丝囊毒素易聚合形成絮凝物,大部分蛋白在初期即同时被洗脱,因而分离效果不佳。由此我们推测,水母刺丝囊中存在一类水溶性好、吸附力强、有助于提升毒素蛋白亲水性的小分子物质,对毒素蛋白结构稳定、活性维持起着至关重要的作用。基于上述推测,我们将水母刺丝囊提取液经脱盐、HPLC（high performance liquid chromatography）反相C18柱分离后,ESI-MS检测发现一组相对分子质量等差 129 的系列小分子（依次为:516 Da、645 Da、774 Da、903 Da、1032 Da、1161 Da、1290 Da、1419 Da）。该系列小分子的分子量均为129的倍数（4～11×）,提示是以129为结构单元的聚合物,且该系列聚合物没有起始单元,为均一的聚合。进一步的氨基酸组成分析发现其仅由谷氨酸（glutamic acid,Glu）一种氨基酸组成。Glu的相对分子质量为147,谷氨酸残基相对分子质量为129,要形成分子量为129倍数的分子结构,有两种可能性:①N端是分子内封闭（焦谷氨酸）的肽链;②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性,其可以γ-羧基形成肽键,因此可能的分子结构有4种类型,即环α、环γ、焦谷α、焦谷γ。为了进一步明确其分子结构类型,我们以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表,化学合成了其所有可能的四种结构类型。最终比对确定,该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸（cyclo-y-polyglutamic acid,cyclo-γ-PGA）,分别由4-11个谷氨酸残基组成。我们进一步验证了 cyclo-y-PGA确实具有增加毒素蛋白亲水性和稳定性的作用,且对离体细胞和整体动物均无毒性作用。可见cyclo-γ-PGA具备了优质生物材料的特点,因此本课题第三部分即利用cyclo-y-PGA作为涂层材料包裹纳米胶束,并深入分析cyclo-γ-PGA作为纳米胶束涂层的潜在优势。第三部分常用化疗药物水溶性低、稳定性差、体内循环时间短、缺乏肿瘤靶向性,影响治疗效果,甚至引起严重毒副作用。而纳米载体可以增强药物的肿瘤靶向性,提升药物稳定性并延缓药物释放。本课题第二部分,从水母刺丝囊分离鉴定了一组全新的小分子cyclo-γ-PGA,与链状γ-聚谷氨酸一样存在大量游离羧基,但又具有环肽结构,性能更加稳定。因此,本部分首先以光敏剂原卟啉（Protoporphyrin Ⅸ,PpⅨ）和含二硫键的硫辛酸（alpha lipoic acid,LA）为疏水基团,亲水肽（NLS）为亲水基团,设计制备了双重响应性纳米胶束NLS-LA-PpⅨ。其次,利用从水母刺丝囊分离鉴定到的全新环状小分子cyclo-γ-PGA包裹前期设计合成的载阿霉素（doxorubicin,DOX）纳米胶束,制备cyclo-γ-PGA涂层的载阿霉素纳米胶束NLS-LA-PpⅨ-DOX@cyclo-γ-PGA,评价cyclo-γ-PGA作为生物涂层在提升纳米胶束稳定性以及利用γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase,GGT）介导的内吞途径增加细胞对胶束的摄取等方面的优势,明确该纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能,并检测其体内外抗肿瘤效应。主要结果如下:1.采用溶剂共挥发法制备纳米胶束,马尔文粒径仪检测显示cyclo-y-PGA涂层后的纳米胶束的粒径稍增大,聚合物分散性指数（polymer dispersity index,PDI）降低,同时电位发生翻转;透射电镜显示加入cyclo-y-PGA后纳米胶束周围出现一圈淡色涂层,胶束呈球形,粒径较均一,以上结果表明cyclo-γ-PGA可以成功包裹于纳米胶束周围。2.cyclo-γ-PGA涂层胶束在高离子浓度以及含血清的培养基条件下,24 h累积释放率较未涂层纳米胶束低,说明cyclo-γ-PGA涂层可以增加纳米胶束在不同介质中的稳定性;类似地,溶血实验显示cyclo-γ-PGA涂层可以减少纳米载体与红细胞相互作用,降低溶血率,加强纳米胶束在血液中的稳定性。3.细胞摄取试验结果表明,cyclo-γ-PGA涂层能够增加细胞对纳米胶束的摄取;进一步利用GGT酶抑制剂GGsTop后证明,cyclo-γ-PGA涂层是通过GGT酶介导的细胞内吞途径来增加细胞对纳米胶束的内化。4.纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能研究显示,当纳米胶束处于pH 5.0/10 mM GSH条件（模拟肿瘤细胞内环境）,72 h的累积释放率显着升高,证明纳米胶束具备良好的还原响应特性。光敏效应研究显示,当施加短时光照时,内涵体膜会发生光化学破裂,引发光化学内在化（photochemical internalization,PCI）效应,从而增强纳米胶束的逃逸,促使药物在细胞质内传递。活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测结果显示,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束处理后的细胞内ROS含量较游离PpIX以及其他纳米胶束组更高,一方面证明cyclo-γ-PGA涂层增加了细胞对纳米胶束的摄取,另一方面也表明更多的光敏剂进入细胞产生更多单线态氧（singletoxygen,1O2）,为下一步研究纳米胶束光动力治疗奠定了基础。5.体外抗肿瘤研究表明,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束较之非涂层纳米胶束展现出更强的肿瘤细胞杀伤作用。活体成像分析显示cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束组展现出良好的肿瘤靶向能力,可以有效减少DOX在其他器官的蓄积,从而降低DOX的毒副作用。体内抗肿瘤试验显示,NLS-LA-PpIX-DOX@cyclo-γ-PGA协同光动力治疗能显着提高DOX的在体肿瘤抑制效果,在显着提高疗效的同时,NLS-LA-PpIX-D6.OX@cyclo-γ-PGA极大地降低了 DOX毒副作用,表现出良好的安全性。总之,本部分研究基于水母刺丝囊来源的新型聚阴离子环状小分子cyclo-γ-PGA,构建了一个在血循环中稳定性良好,具有还原/光刺激双重响应性以及GGT受体靶向功能,化疗与光动力治疗协同作用的聚合物纳米给药体系,为抗肿瘤化疗药物输送体系研究提供新思路。
夏晓东[2]（2020）在《温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响》文中研究说明目的:1.使用温控射频消融球囊对兔正常动脉血管进行纵向线性消融,探讨不同温度射频对兔正常动脉的损伤情况,观察温控射频球囊及单纯球囊对正常血管内膜损伤,增生及纤维组织增生情况,并测量动脉管腔面积,探索射频消融动脉血管合适温度。2.使用温控射频球囊对兔动脉粥样硬化血管进行纵向线性消融,探讨温控射频消融球囊对动脉粥样硬化斑块的影响,并了解其对动脉粥样硬化斑块血管管腔面积影响,测量炎性因子,凋亡因子及TGF-β通路,探索温控射频球囊线性消融动脉粥样硬化血管后血管组织学变化,并探索温控射频球囊消融动脉粥样硬化血管后,促炎细胞因子,抑炎细胞因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2炎症通路变化情况,为临床治疗动脉粥样硬化提供新思路。方法:1.将正常健康家兔分为4组,即单纯球囊扩张对照组,45℃温控射频球囊扩张组,50℃温控射频球囊扩张组,55℃温控射频球囊扩张组。温控射频球囊在扩张后1h,3d,7d留取兔动脉标本,甲醛固定,并进行HE,Masson染色,观察血管增生,胶原纤维变化情况并测量血管腔面积。2.动脉硬化建模:球囊拉伤兔腹主动脉内膜,并联合高脂饮食喂养,建立动脉粥样硬化模型,并在12w时随机处死2只大兔以检验动脉粥样硬化造模是否成功。3.将造模成功的大兔随机分为2组,即使用55℃射频消融扩张及单纯球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,在1小时,7天,14天以及28天留取动脉标本,行HE及MASSON染色,进行病理组织学切片观察,了解温控射频球囊及单纯球囊扩张对动脉粥样硬化血管影响。并应用免疫组化,western blot及荧光定量PCR等方法,检测组织中促炎因子,抑炎因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2通路蛋白水平及组织中m RNA水平的变化。结果:1.与单纯球囊扩张组及对照组比较,应用45℃,50℃,55℃线性消融正常兔动脉血管时,血管管腔面积各统计组之间无统计学差异。2.使用55℃射频扩张粥样硬化血管,在相同时间点,温控射频球囊组血管管腔面积大于单纯球囊扩张组,而随时间延长温控射频消融球囊组及单纯球囊扩张组两组组内血管管腔面积变化不大。温控射频球囊组各组之间管壁厚度无统计学差异。3.组织水平上,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控射频球囊扩张组IL-1β,IL-17,Bax,IFN-γ,TGF-β,Smad-2以及Caspase3表达明显高于单纯球囊扩张组。温控射频消融球囊扩张组表达IL-10及Bcl-2少于单纯球囊扩张组。4.转录水平与蛋白水平,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控球囊扩张组兔子动脉血管中Bcl-2的整体表达量要明显低于单纯球囊扩张组。但是,温控射频球囊扩张组兔子动脉血管中Bax,TGF-β,Smad-2以及Caspase3的整体表达量要明显高于单纯球囊扩张组。结论:1.使用温控射频消融球囊消融兔正常血管时,45℃,50℃,55℃均可对正常血管造成损伤,但与单纯扩张组比较,血管管腔面积变化不大。虽然随温度升高,血管壁损伤范围也相应扩大,但即使是使用55℃对正常血管进行30s消融,仍然是安全的。2.使用55℃射频消融球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,可使动脉粥样硬化血管管腔面积增大,可能与球囊挤压斑块,射频能量对血管造成线性损伤,血管顺应性增加,在动脉血压的作用下,扩张动脉粥样硬化血管。3.射频消融动脉粥样硬化血管时,消融部位动脉粥样硬化斑块可发生纤维化,可有助于动脉粥样硬化斑块稳定。4.射频消融可使消融部位促炎症细胞因子表达增加,抑炎细胞因子表达减少,凋亡受到抑制,同时TGF-β/smad2通路被激活。这也提示,虽然射频消融能增加血管面积,但同时炎症通路也被激活,如应用于临床,应同时应用抑制炎症反应药物。维持射频消融球囊扩张远期效果。
王明辉[3]（2019）在《LncRNA MEG3及miRNA-361-5p在冠状动脉粥样硬化中的作用及机制》文中进行了进一步梳理研究背景血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖和凋亡是动脉粥样硬化发生、发展的重要原因。当血管局部受到损伤后可发生一种修复反应,是由多种细胞因子和生长因子所介导的局部血管重建和重构,主要包括血管平滑肌细胞的增殖和凋亡,细胞外基质的分泌和堆积及内膜增生。这对于动脉粥样硬化性疾病具有重要意义。而近年来的研究发现长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lnc RNAs）及微小RNAs（micro RNAs,mi RNAs）均对VSMCs的增殖及凋亡具有重要的调控作用,故对lnc RNAs及mi RNAs与VSMCs关系的研究也成为了目前的热点。目前发现的lnc RNAs与mi RNAs数量庞大,作用机制丰富。其中的研究重点之一是竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs,ce RNA）假说。这一发现被用于解释RNA语言在调节RNA串扰及控制生物学功能中的作用。目前已经确定mi RNAs可以通过与目标m RNAs结合而导致m RNAs基因沉默。而lnc RNAs可以作为一种ce RNA,与mi RNAs产生相互作用,共同参与目标m RNAs的表达调控。Lnc RNAs（ce RNAs）能够通过应答元件与mi RNAs结合,从而影响mi RNAs导致的基因沉默。近期有研究提示lncRNA人母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）可能与VSMCs的增殖及凋亡过程存在关联,而针对其在VSMCs的增殖及凋亡过程中的可能机制,是本课题所关住的重点。因此,我们通过生物信息分析,选定MEG3,其可能通过特异性结合mi RNA-361-5p调节ATP结合盒蛋白A1(ATP-binding cassette protein A1,ABCA1的表达,共同参与VSMCs的增殖及凋亡。研究目的:通过建立细胞模型,探讨MEG3及mi R-361-5p与VSMCs的增殖及凋亡之间的关系及其相互作用机制。观察ACS患者外周血MEG3与mi R-361-5p的表达水平,以及不同冠脉病变形态及冠脉内介入治疗与RNAs表达变化量之间的关系。方法及结果:方法:以氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）处理VSMCs建立模型,通过实时定量荧光PCR（Real-Time Transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）方法检测MEG3、mi R-361-5p、ABCA1等RNAs在该模型中的表达,以免疫印迹试验（western blot）检测ABCA1表达。使用CCK-8增殖试验及流式细胞术分别检测VSMCs的增殖及凋亡。通过敲除及过表达系统进一步确定以上因素在VSMCs增殖及凋亡过程中的分子机制。通过荧光酶素报告及生物信息学分析确定MEG3、mi R-361-5p及ABCA1之间的靶定关系。连续入选2018年8月至2018年10月于我院住院治疗的临床资料完整的具有胸痛症状的患者数据。根据患者临床症状、心电图改变、心肌损伤标志物变化情况及冠状动脉造影结果,将患者分为非冠心病组、稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组及心肌梗死组。除给予标准心内科规范治疗外,根据冠脉造影结果及患者意愿,为患者行经皮冠状动脉介入治疗。通过RT-PCR方法检测患者冠脉造影或介入治疗前后MEG3、mi R-361-5p及ABCA1的表达。比较不同组患者间三种RNAs的表达差异。同时分析冠状动脉病变形态与RNAs表达水平的关联。并进一步研究冠脉靶病变的复杂程度及支架植入情况与RNAs表达变化量之间的联系。结果:在ox-LDL诱导损伤的VSMCs模型中MEG3表达水平下调,并与mi R-361-5p的表达存在关联。抑制MEG3可促进VSMCs的增殖并抑制细胞凋亡。此外,MEG3可以作为mi R-361-5p的ce RNA,通过影响ABCA1的表达调控VSMCs的增殖及凋亡。心肌梗死患者中mi R-361-5p表达水平较其他组患者上调,不稳定心绞痛组ABCA1表达水平低于其他组患者,lnc RNA MEG3在各组患者间表达无明显差异。在冠状动脉具有侧支循环的患者中,lnc RNA MEG3表达水平下降,而mi R-361-5p表达升高,但未显示其与冠脉病变的严重程度存在关联。PCI术后患者mi R-361-5p表达水平较术前上调,ABCA1表达水平下降,lnc RNA MEG3无明显改变。三种RNAs表达量变化未显示出与靶病变复杂程度存在关联。而mi R-361-5p表达变化与支架长度呈正相关,ABCA1表达变化量与支架长度呈负相关。结论:1、MEG3可以作为mi R-361-5p的ce RNA,通过影响ABCA1的表达调控VSMCs的增殖及凋亡。2、心肌梗死患者中mi R-361-5p表达水平较其他组患者上调,不稳定心绞痛组ABCA1表达水平低于其他组患者。3、MEG3与mi R-361-5p可能与冠脉侧支循环的建立存在关联。4、mi R-361-5p与ABCA1可能参与了PCI术后的血管重塑过程。
汤涌[4]（2018）在《胸腺素β4基因调节内皮细胞功能及其干预心肌损伤的研究》文中进行了进一步梳理第二部分 胸腺素β4基因修饰内皮细胞的体外研究目的:利用腺病毒载体转染技术研究Tβ4基因修饰内皮细胞的作用。方法:本研究成功将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行培养,将Tβ4腺病毒转染细胞,采用不同方法观察细胞功能。采用常氧和缺氧条件测试细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖;Transwell法测定细胞迁移;Western Blotting法检测信号通路蛋白表达。结果:在常氧和缺氧条件下Ad-T β 4组细胞凋亡都减少,尤其Ad-Tβ4缺氧组细胞凋亡率比Ad-NC缺氧组减少更加明显（12.35%VS 21.24%,p<0.05）,这种作用能够被Ly294002阻断（20.94%）;MTT法Ad-T β 4组和对照组和Ad-NC组比较,细胞72小时后增殖率明显增加（0%VS 3.23%VS 60.04%,P<0.05）;Transwell法常氧条件下Ad-T β 4组细胞计数（54.56±3.09）比Ad-NC组（42.11±2.71）和Ad-T β 4+Ly组（14.89±2.80）明显增多,p<:0.01;Western Blotting法在常氧条件下Ad-T β 4组Caspase3相对表达没有太大变化,而在缺氧条件下Ad-T β 4组Caspase3相对表达较其他组明显减少。在常氧条件下Ad-T β 4组p-Akt相对表达增加,缺氧条件下Ad-T β 4组p-Akt相对表达也比其他组增加,PI3K抑制剂Ly294002显着降低了其表达。结论:腺病毒携带T β 4基因可以有效转染内皮细胞,修饰后的内皮细胞更具有生存活力和治疗应用价值。在缺氧条件下,Tβ4可以提高PI3K表达和酶解活性增加其下游因子Akt的活化。第三部分 携带Tβ 4基因腺病毒治疗家猪急性心肌梗死的作用研究目的:通过动物实验研究观察携带T 4基因腺病毒对于急性心肌梗死后缺血损伤的影响。方法:成功建立了 12例家猪急性心肌梗死动物模型,分为三组,Ad-T β 4组、Ad-NC组、对照组,分别经冠状动脉注射Tβ 4腺病毒、NC腺病毒、生理盐水。造模成功后第2天、第30天,经3.0T磁共振检查心脏功能和梗死面积;梗死部位心肌组织做成组织匀浆,离心后ELISA方法测定T β 4含量。统计学分析比较。结果:造模成功后第2天三组的梗死面积占比、EF值都没有显着差异。第30天,梗死面积占比（%）在Ad-Tβ4 4组（22.6±3.2）比Ad-NC组（28.0±2.7）和对照组（27.1±1.5）明显减少,差异有统计学意义（p<0.05）;EF值（%）在Ad-Tβ 4组（48.75±3.77）比另两组增高,与对照组（41.25±2.99）比较差异有统计学意义（p<0.05）。Tβ4含量在Ad-Tβ 4组（9.039±2.531ng/ml）明显比对照组（2.139±0.953ng/ml）和Ad-NC组（2.071±0.797ng/ml）增高,差异有统计学意义（p<0.05）。结论:Tβ 4基因腺病毒对急性心肌梗死后的缺血损伤产生有利的影响,并改善了心功能。第四部分 脾功能亢进对心力衰竭患者胸腺素β 4水平的影响目的:观察脾功能亢进合并心力衰竭患者中氧化应激产物和胸腺素β4的水平及内皮细胞功能的变化,揭示脾功能亢进恶化心力衰竭的机制。方法:慢性心力衰竭NYHA心功能分级III或IV级的患者,合并脾功能亢进者33例,不合并脾功能亢进者35例。MACS法分离EPCs,PCR定量,TUNEL分析评估细胞凋亡。ELISA方法检测VCAM-1、ICAM-1、P选择素、E选择素、游离血浆血红蛋白、Tβ 4血清浓度,绿高铁血红蛋白检测游离亚铁血红素血清浓度。结果:游离血浆血红蛋白（pg/ml）和亚铁血红素（pg/ul）在CHF合并脾功能亢进患者中比对照组明显增加（307.75土130.49 vs.212.46±121.11,P<0.001;and 1.96±0.82 vs.1.26±0.77,P<0.001,respectively）VCAM-1、ICAM-1、P选择素和E选择素表达水平在CHF合并脾功能亢进患者中比对照组更高（p<0.001）。24个月后与对照组比较,CHF合并脾功能亢进LVEF明显降低（41.06%±7.77%vs.47.05%±10.62%,P=0.01）,游离血浆血红蛋白和亚铁血红素水平和LVEF有明显对应关系（r=-0.29,P=0.015;and r=-0.28,P=0.020,respectively）。CHF合并脾功能亢进患者的EPCs显示有明,显的增值能力下降（p<0.001）,缺血刺激6小时后发现TUNEL+ EPCs（%）比对照组显着增加（36.5±11.8 vs.21.2±7.4,P<0.001）。胸腺素β4水平在CHF合并脾功能亢进组比对照组明显降低（5.80±3..85 ng/ml vs.8.3.4±4.06 ng/ml,p<0.05）,通过直线回归,我们发现LVEF作为因变量与胸腺素β4水平呈明显的正直线相关,R=0.331,P=0.006。结论:脾功能亢进通过激活氧化应激反应和内皮功能障碍恶化了心功能,胸腺素β4在脾功能亢进中减少,并和心功能衰竭程度相关。第一部分携带胸腺素β4基因序列腺病毒载体制备目的:本研究利用全基因合成的质粒构建腺病毒表达载体,并进行腺病毒的包装和滴度测定。方法:本实验采用的是AdMax系统的真核腺病毒包装体系。先对目的基因序列进行分析检查,然后根据基因序列分析结果,进行设计合成、酶切、拼接,将合成好的序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α,测序并扩增片段,制成含有目的序列的GFP共表达质粒,设计PCR扩增引物扩增后使用Invitrogen公司的重组系统将上述目的片段重组到载体pAD/CMV/V5-DEST上。构建的腺病毒表达载体经Pac I消化后转染293A细胞,包装病毒。在病毒滴度检测方面,本实验采用了免疫法来检测腺病毒的滴度。结果:腺病毒载体重组质粒成功制作。确定腺病毒的滴度为2.12×1010ifu/ml。结论:可以通过全基因合成的途径成功制备携带Tβ4基因序列的腺病毒载体。
贺春晖[5]（2016）在《靶向干预NF-κB信号通路防治老龄缺血性心力衰竭的作用机制研究》文中研究表明目的:本研究旨在探讨NF-κB对急性心肌梗死后缺血性心力衰竭作用的影响,研究老龄心肌在急性心肌梗死期和慢性心力衰竭形成过程中的分子机制;通过研究使用巨细胞病毒（CMV）启动子重组单链AAV9（ssAAV9）载体和双链AAV9（dsAAV9）的组织表达特异性,筛选获得较好的可用于心脏疾病基因治疗的AAV9载体;并使用携带IκBα（inhibitor ofκBα,IKBα）基因的重组AAV9载体,靶向转导老龄小鼠心脏,探讨外源导入IKBα能否作为基因治疗药物,具有靶向抑制NF-κB通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡和防治老龄心肌缺血心力衰竭的作用及机制。本研究包括:（1）应用小鼠急性心肌梗死模型,研究缺血后老龄小鼠心肌急性期和慢性心力衰竭期NF-κB信号通路表达的差异,阐明缺血后心肌不同时期NF-κB参与的分子机制。（2）通过体外转导实验,对比研究杆状病毒载体系统包装制备的CMV启动子在重组ssAAV9和dsAAV9载体介导GFP基因在小鼠体内的组织表达特异性及表达时间点,筛选更适宜用于心脏疾病基因治疗的重组AAV9载体。（3）靶向转导IKBα基因至老龄小鼠心肌,通过在体心肌梗死模型和缺血性心力衰竭模型,探讨IKBα基因过表达减轻老龄心肌缺血损伤的作用机制。方法:第一部分:选取15～18月龄的近交系雄性C57BL/6J小鼠,开胸结扎左冠状动脉,建立小鼠急性心肌梗塞模型,随机分为假手术组（sham operation,SH）20只,心梗组（myocardial infarction,MI）70只,观测指标为小鼠心脏破裂发生、心肌梗死面积、左心室重构情况、心电图改变、心肌细胞凋亡、IKBα、p65、p50、IL-6、IL-10、MMP-2、MMP-9和TIMP的表达。第二部分:将剂量为1×1011vg的ssAAV9-CMV-eGFP及dsAAV9-CMV-eGFP载体分别经尾静脉注射导入C57BL/6J小鼠体内,于病毒载体转导0周、1周、2周、3周、4周、5周和8周,利用激光共聚焦和Western Blot检测心、肝、脾、肺、肾及脑中GFP蛋白表达,研究AAV9病毒颗粒的体内分布与存在时间,系统评价CMV启动子重组ssAAV9和dsAAV9载体的组织靶向性。第三部分:选取15～18月老龄雄性C57BL/6J小鼠,分别经尾静脉注射生理盐水,ssAAV9-CMV-eGFP和dsAAV9-CMV-IKBα,5周后采用Western Blot法检测心肌中IKBα、p65、p50的表达;并于病毒转染5周后,采用小鼠结扎冠状动脉建立心肌梗死模型,建模处理同第一部分;心梗模型建立后分别观察3天和28天,观察指标为生存情况、心肌梗死面积、细胞凋亡,心肌酶CK、LDH水平,肝酶ALT、AST水平,肾功Cre、Bun水平,Bcl-2、Bax的表达。结果:第一部分:（1）与假手术组相比,MI组出现明显的左室扩张和心功能障碍,心梗3天时出现明显的梗死区变薄扩张和收缩功能障碍,表现为LVEDd、LVESd、EXLVDd明显增加,Pws、Pwd和FS值明显降低（P<0.05）。（2）心梗后不同时间,免疫组化显示老龄组p65、P50阳性细胞数较假手术组高,差异有统计学意义（p65 400 vs154,p50 179 vs 83,P<0.05）;WestemBlot检测发现心梗3天,28天时老龄组p65蛋白表达均高于假手术组,说明老龄小鼠心梗后NF-κB活性较假手术组高。第二部分:（1）激光共聚焦和Western Blot检测发现CMV重组ssAAV9和dsAAV9载体转导5周时,GFP蛋白主要在心肌和肝脏中表达,脾、肺、肾及脑中几乎未见表达。（2）各检测时间点dsAAV9载体所介导的GFP蛋白在心肌中的表达显着高于ssAAV9所介导的GFP表达。AAV9载体转导1周后在心肌和肝脏中开始表达GFP蛋白,随着时间的延长表达逐渐增强,转导第5周到达高峰,其在心脏转染效率（84.0±3.2%vs 73.6±3.4%,P<0.01）,在肝脏转染效率（23.0±4.2%vs 17.6±3.4%,P<0.01）;第8周时心脏转染效率为（75.0±3.5%vs 70.2±0.3%,P<0.01）,在肝脏转染效率（20.0±3.2%vs 15.6±3.4%,P<0.01）,表明dsAAV9-CMV-eGFP载体对心肌有更强的靶向亲和力,可在心肌中长期稳定的高效表达,但CMV启动子活性在肝脏中容易被沉默。第三部分:（1）IKBα基因转导可抑制老龄心肌NF-κB信号通路,与空病毒组相比,IKBα、p65、p50的表达在胞浆内显着增加（P<0.01）,而在胞核内p65、p50的表达显着降低（P<0.01）。（2）在动物整体水平上,IKBα基因过表达有效保护老龄缺血性心力衰竭。空病毒组、IKBα基因转导组心肌梗死面积分别为40.0±7.7%vs34.0±8.0%,心肌细胞凋亡率分别为15.3±2.1%vs 5.1±1.3%,心梗面积及细胞凋亡率与空病毒组相比差异均有统计学意义（P<0.01）,表明NF-κB信号通路抑制后有效保护老龄缺血心肌。NF-κB基因过表达可有效降低老龄心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率,并改善生存率。老龄心肌梗死28天后,空病毒组及IKBα组的心梗面积分别为41.4±6.0%vs 35.5±4.7%;心肌细胞凋亡率分别为15.4±2.0%vs 5.5±2.3%,与空病毒组相比P<0.01;凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax显着增加,与空病毒相比（P<0.01）。（4）IKBα组的心肌酶CK、CK-MB和LDH亦显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）NF-κB信号通路是参与急性心肌梗死后缺血性心力衰竭心肌损伤作用关键靶点。急性缺血早期通过激活NF-κB信号通路引起心肌损伤;心肌慢性缺血性心力衰竭过程中,NF-κB持续激活,在心力衰竭的进展中起关键作用;（2）CMV启动子的重组dsAAV9载体可在心肌中长期稳定的高效率表达,但在肝脏中CMV启动子活性很容易被沉默,AAV9-CMV载体是一种较为理想的心脏疾病基因治疗载体;（3）靶向抑制心肌NF-κB信号通路激发心肌内源性抗损伤能力是防治老龄心肌缺血性心力衰竭的关键环节,IKBα基因可以作为小分子基因治疗药物,具有靶向抑制NF-κB信号通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡,防治老龄缺血性心力衰竭的效果和作用,从而有效保护老龄心肌缺血损伤。
范平[6]（2013）在《肌浆网钙ATP酶基因转导治疗急性心肌梗塞的实验研究》文中提出目的：1)通过扩增和纯化重组腺病毒携带肌浆网钙ATP酶（rAd.SERCA2a）基因,获得高效价的rAd.SERCA2a基因,可满足基因转染浓度和数量的需要,同时也为扩增和纯化肌质网Ca2+-ATP酶（SERCA2a）基因提供一种稳定高效的实验方法,也为心力衰竭（HF）的基因治疗研究提供基础。2)本研究是建立在急性心肌梗塞（AMI）动物模型基础上,分别采用经典的骨髓干细胞（BMSC）治疗、SERCA2a基因治疗以及SERCA2a基因修饰的BMSC移植（BMSC+SERCA2a）治疗方法,运用组织病理技术,无创心电技术,超声技术,组织细胞电生理技术,对比三种方法治疗效果的差异性和优越性,分别探讨BMSC治疗AMI、转SERCA2a基因治疗心肌梗塞后心力衰竭的有效性,以及两者联合治疗的可行性,评价BMSC作为基因载体策略的可行性。本研究在改善心脏功能,纠正心梗后心力衰竭,防止心室重塑方面进行研究,重点探讨国、内外研究都比较薄弱的环节即：转SERCA2a基因治疗/BMSC移植治疗/BMSC+SERCA2a治疗AMI后的心脏电一机械匹配和电生理特性的改变,导致/减少/防止心律失常的发生进行评估,为以细胞移植为基础的基因治疗AMI提供临床应用基础。方法：1)复苏和传代人胚肾细胞（HEK-293）,用100μl1.9×1012pfu/ml rAd.SERCA2a感染HEK-293细胞,出现细胞病变效应时收获细胞,经物理反复冻融方法及两步氯化铯超速离心方法获得纯化的rAd.SERCA2a,紫外分光光度计比色法测定病毒DNA质粒数。2)将急性心肌梗塞后心力衰竭动物模型制作成功的26只成年雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组（n=10）,空病毒对照组（rAd.β-gal组,n=8）和SERCA2a基因转染组（rAd.SERCA2a组,n=8）。假手术组仅开胸不结扎冠状动脉,rAd.β-gal组和rAd.SERCA2a组分别进行左冠状动脉前降支结扎建立大鼠心肌梗塞后心力衰竭动物模型,同时分别将携带β-gal和SERCA2a基因的重组腺病毒导入衰竭心脏,术后2周超声心电图检测心脏的舒张和收缩功能,心电图监测体表心电活动,微电极阵列（MEA）监测离体心脏组织电活动情况。3)建立成年雄性SD大鼠AMI模型（n=24）。随机分为3组：盐水对照组（对照组,n=8）,BMSC移植组（BMSC组,n=8）,SERCA2a基因修饰的BMSC移植组（BMSC+rAd.SERCA2a组,n=8）。术后2周进行心脏B超、体表心电图及MEA技术评估心功能和心脏电活动变化。4)制作成年雄性SD大鼠AMI动物模型（n=38）。随机分为5组：SERCA2a基因组（rAd.SERCA2a组,n=8）,BMSC移植组（BMSC组,n=8）,SERCA2a基因修饰的BMSC移植组（BMSC+rAd.SERCA2a组,n=8）,盐水对照组（shame组,n=7）,腺病毒空载体组（rAd.LacZ组,n=7）。术后2周记录体表心电图以及运用心脏二维超声评价心功能,HE染色评估心脏组织形态改变,运用MEA技术评估离体心脏组织电活动情况。结果：1)SERCA2a基因在HEK-293细胞成功呈绿色荧光表达,纯化的rAd.SERCA2a.GFP DNA质粒数为1.3±0.58×1012pfu/ml, OD260/OD280比值为1.57±0.49（n=50）。2)rAd携带SERCA2a与β-gal基因均成功转入大鼠衰竭心脏。Ad.SERCA2a组可改善心功能,与假手术组相比心室舒张末期容积与心室收缩末期容积有轻微的增加[（0.410±0.130） cm2对（0.39±0.02） cm2,（0.08±0.02） cm2对（0.06±0.01） cm2, P>0.05]、左心室射血分数[（82.3±4.59）%对（85.56±1.26）%,P>0.05]和短轴缩短率[（46.6±2.32）%对（49.58±1.71）%,P>0.05]无明显改变。与假手术组相比,rAd.β-gal组体表心电图QT间期延长[（111.02±7.42）ms对（94.7±1.55）ms,n=6,P<0.05],室性早搏发生率达71.5%（5/7）,而rAd.SERCA2a组QT间期缩短[（81.45±4.97）ms对（94.7±1.55） ms,n=6, P<0.05],室性早搏发生率达14.3%（1/7）。MEA记录可发现rAd.SERCA2a组心率与假手术组相比差异无统计学意义[（435±31）bpm对（442±22） bpm, n=6, P>0.05],与rAd. β-gal组相比,rAd.SERCA2a组最大场电位[（0.82Q0.39）mV对（0.64±0.13）mV,n=6,P<0.05]、最小场电位[（1.88±0.57）mV对（1.35±0.12） mV, n=6,P<0.05]、场电位时限[（124.17±21.08）ms对（113.23±12.02） ms, n=6, P<0.05]均延长；rAd.β-gal组梗死区与梗死对侧区心肌组织场电位时限差异有统计学意义[（60.36±2.08）ms对（103.24±7.35） ms, n=5, P<0.05],并且60通道记录梗死区心肌组织场电位时程离散度大于rAd.SERCA2a组[（38.5ms±4.62） ms对（26.88±5.09） ms, n=5]; rAd.SERCA2a组传导基本一致,使心肌梗塞面心室肌组织电活动呈均一性传导。3)rAd.SERCA2a基因对BMSC的感染效率为80%～90%。BMSC组、BMSC+rAd.SERCA2a组大鼠左室射血分数明显优于对照组（n=6,P<0.05）。BMSC+rAd.SERCA2a组大鼠体表心电图QT间期为（80.30±6.53）ms比对照组（105.31±21.89）ms少了23.8%（P<0.05）,对照组室性早搏较多。MEA记录可发现梗死面心肌组织最大场电位BMSC组为（0.51±0.15）mV、BMSC+rAd.SERCA2a组为（0.55±0.16）mV,均明显高于对照组的（0.23±0.1）mV（P均<0.05）,场电位时程BMSC组为（104.5±25.43）ms、BMSC+rAd.SERCA2a组为（107.67±24.01）ms,均显着长于对照组的（63±20.34）ms（P均<0.05）。BMSC+rAd.SERCA2a组传导时间最短,且能显着改善心梗面心室肌组织的均一性传导。4)rAd.SERCA2a组[（82.62±2.58）%]、BMSC组[（80.24±4.15）%]、BMSC+rAd.SERCA2a组[（84.28±2.46）%]与shame组[（70.49±3.27）%]相比射血分数均有明显改善（P<0.05,n=6）,而rAd.LacZ组[（71.34±2.42）%]与shame组相比差异没有统计学意义（P>0.05,n=5）。体表心电图可发现与shame组[（102.42±20.67）ms,n=7]相比,QT间期在rAd.SERCA2a组[（83.07±17.56）ms,n=6]和BMSC+rAd.SERCA2a组[（81.20±5.64）ms,n=7]均值明显减少18.9%和20.7%（P<0.05）,在shame组和rAd.LacZ组也出现较多的室性早搏。MEA记录可发现对照组离体心脏搏动频率明显减慢,并出现室性心律失常和房室传导阻滞。离体心脏组织场电位时程（FPdur）在rAd.SERCA2a组（121.25±18.64） ms BMSC组（106.12±20.76）ms和BMSC+rAd.SERCA2a组（106.35±19.51）ms（n=6）显着长于shame组[（60.45±19.12） ms, n=6]（P<0.05）,其中rAd.SERCA2a组较显着地增加心梗区心室肌场电位及减少心律失常发生。rAd.SERCA2a组和BMSC+rAd.SERCA2a组能够从组织形态上阻止梗死心肌发生变性和坏死。结论：1)本研究建立了稳定可靠的借助HEK-293细胞培养扩增rAd.SERCA2a的实验方法,纯化后的高效价的SERCA2a基因的重组腺病毒可直接用于心血管疾病的动物实验研究,对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法也具有一定的参考价值。2)BMSC是一种有效的基因治疗运载体。3)腺病毒载体介导的SERCA2a基因过度表达能够在短期内有效地增强心脏功能,增加梗死心脏的搏动频律和显着改善梗死心肌的电传导和减少心律失常发生。4)SERCA2a基因、BMSC移植以及SERCA2a基因修饰BMSC移植均可以明显改善心肌梗塞后心脏功能,但过表达SERCA2a基因可以减少心肌坏死和延缓心室重构,rAd.SERCA2a组可以更有效地增加心梗区心室肌场电位、改善心梗面心室的均一性传导,并能够预防心梗后心律失常的发生。5)MEA技术是一项检测心血管疾病动物模型心脏组织电生理节律和频率以及传导活动的理想技术。MEA技术在细胞或基因治疗的心脏电活动研究方面具有重要的应用价值。
寿松涛[7]（2008）在《Ad-hVEGF121重组腺病毒基因治疗对急性心肌梗死大鼠心脏保护作用的实验研究》文中认为心肌梗死是缺血性心脏病的严重且致死率极高的一种临床表现形式。冠状动脉旁路移植术（CABG）和经皮冠状动脉干预（PCI）对冠心病的治疗已比较成熟,但对于冠状动脉弥漫性病变及陈旧性心肌梗死心功能较差者效果尚不理想。基因治疗是缺血性心脏病的新探索。血管内皮生长因子（Vascular EndothelialGrowth Factor,VEGF）也称为血管通透因子（vascular permeability factor,VPF）,对血管内皮细胞具有高度特异性促有丝分裂作用。其通过与血管内皮细胞的特异性受体结合,具有强大的促内皮细胞增殖、促进血管生成作用。研究发现,其他血管生成因子的作用是全部或部分通过增强VEGF的表达及生成实现的。促进VEGF表达或利用基因治疗方式给予心肌缺血患者VEGF,促进心肌局部VEGF表达,增加缺血心肌血管生成,为心肌缺血治疗提供新的治疗方式。目的建立大鼠急性心肌梗死模型,将以腺病毒为载体的人血管内皮生长因子(Ad-hVEGF121)注射感染至心肌内,观察其对缺血心肌血管生成、心室结构和功能以及心肌细胞凋亡的影响,探讨其治疗心肌梗死的可能机制。方法1.构建hVEGF121腺病毒表达载体。利用293T细胞包装扩增Ad-hVEGF121重组腺病毒,获取大量含hVEOF121的腺病毒;用PCR法鉴定扩增的腺病毒;用光密度法在OD260测定腺病毒滴度。2.将78只清洁级雄性SD大鼠,体重250～300g随机分为四组:心梗+VEGF感染组（AMI/VEGF组）,心梗+生理盐水组（MI/NS组）,单纯心梗组（AMI组）和假手术组（sham组）。VEGF组、MI/NS组、AMI组都行结扎冠状动脉前降支而假手术组只穿线不结扎。3.结扎冠状动脉后稳定10～15分钟,VEGF组和MI/NS组用微量注射器分别向心肌梗死区分三点直接注射Ad-hVEGF121或NS(每点20μl,总量为×1010vp),AMI组结扎后关闭胸腔,术后继续喂养2周。术后14天行心脏超声检查左室结构和心功能。超声检查后处死大鼠,取出心脏剪去心房和右室,将室间隔保留在左室,垂直于左室长轴将左室分成上下两部分,上部分置-80℃冻存,用于提取总RNA并用RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3及hVEGF121的mRNA表达。下部分经甲醛固定后,石蜡包埋切片,进行HE染色,计算梗死面积;免疫组化vWF染色计数毛细血管密度;TUNEL法计数细胞凋亡率。结果1.用293T细胞包装扩增的Ad-hVEGF121腺病毒,扩增后病毒滴度为1.155×1012v.p/ml。PCR扩增产物为476bpDNA片段,显示成功构建重组腺病毒Ad-hVEGF121。2.阻断大鼠冠状动脉前降支血流后,心电图显示ST段抬高,QRS综合波幅度增高,术后14天的大鼠心脏大体标本可见左室局部苍白,室壁明显变薄,无血管瘤生成。HE染色可见左室前壁局部穿壁梗死灶。模型成功率67.9%。3.实验终点时,心肌梗死各组大鼠的体重较sham组大鼠明显减轻（p＜0.01）。超声心动图结果显示,心肌梗死大鼠均表现LVEDd和LVEDs增大,与sham组大鼠比较有显着差异（p＜0.05）。直接心肌注射Ad-hVEGF121能在一定程度缩小大鼠左室内径和左室重量/体重比值,增加LVEF,但与MI/NS和MI组大鼠比较无统计学差异（p＞0.05）。4.HE染色结果显示,除sham组外,各组间梗死面积无显着差异（p＞0.05）。免疫组化vWF阳性内皮细胞测量结果显示:心肌梗死大鼠新生毛细血管密度较sham组显着增多（p＜0.001）,转染rAd-hVEGF121大鼠新生毛细血管密度较MI/NS组和AMI组增加（p＜0.05）。5.RT-PCR结果显示,AMI后2周,梗死组大鼠梗死区bcl-2、bax和caspase-3的mRNA表达明显增加,与sham组比较有显着差异（p＜0.01）。但转染rAd-hVEGF121大鼠的bcl-2和bax的mRNA表达灰度值与AMI和MI/NS组比较无差异（p＞0.05）。TUNEL结果显示,VEGF组心肌细胞凋亡率较MI/NS组和AMI组显着降低（p＜0.05）,而且以梗死周围区凋亡明显。结论:1.结扎大鼠冠状动脉前降支能成功构建稳定的急性心肌梗死大鼠模型;2.直接心肌注射Ad-hVEGF121(1×1010vp)能在一定程度改善心肌梗死大鼠心脏结构和心功能,这可能与其增加新生毛细血管密度,降低心肌细胞凋亡有关;3.Ad-hVEGF121并非通过上调凋亡抑制因子bcl-2和下调凋亡促进因子bax的表达而抑制心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡,可能是通过改善“凋亡调节因子”bcl-2/bax和下调caspase-3表达实现的;4.每只大鼠心肌注射Ad-hVEGF121(1×1010vp)无明显副作用,是安全的。
董书强[8]（2001）在《腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生的研究》文中研究说明缺血性心脏病（IHD）是当代人类发病率和致死率较高的疾病之一，由于冠状动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏，产生心绞痛、心肌梗死、心律失常、心功能衰竭和猝死，目前主要的治疗措施是开胸手术进行冠状动脉旁路移植（CABG）、经皮腔内球囊血管扩张（PTCA）或者药物治疗，尽管已取得了很大的进步，但仍有约5％的患者因严重而弥漫的病变、缺乏血管桥和吻合血管以及高手术危险等而不适合以上的治疗措施。 各种血管生长因子的相继发现给IHD患者的治疗带来了希望，心肌缺血可诱导一些生长因子的产生形成一定数目的侧枝血管，但不能满足自身的需要，研究者开始尝试增加缺血区生长因子浓度的方式，以其通过增加侧枝血管的生长而减轻心肌缺血、预防心肌梗死和保存心脏的功能，即“治疗性血管新生”（TherapeuticAngiogenesis），近年的研究预示这将为IHD的治疗提供一条全新而有效的途径。 目前研究的血管生长因子主要集中在血管内皮生长因子A（VEGF—A）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管形成素（angiopoietins）等，由于各自的生物学特性和作用特点不同，缺乏相互比较，尚不能确定何者为首选。新近发现的血管内皮生长因子B（VEGF-B）结构与VEGF－A相似，分布广泛，在心脏较为丰富，与 VEGF家族的受体之一 VEGFR-1和 neuropolin-1结合，研究表明内皮细胞和其周细胞存在编码VEGF-B的mRNA，VEGF-B能够促进培养的血管内皮细胞（ECs）的生长，并增加纤溶酶的活性从而调节血管外基质的降解、细胞粘附和迁移，敲除VEGF-B基因的鼠心脏体积减小阻塞冠状动脉后的恢复受限，提示该因子影响冠状血管的发育和生长，提示有潜在的治疗作用。与 VEGF不同的是，缺氧并不明显增加VEGF—B mRNA的表达，缺血心肌VEGF－B的缺乏可能是内在血管生长不足的原因之一，目前关于VEGF-B的血管新生作用的研究尚未见报道。 基因治疗是目前研究的热点，腺病毒介导的基因转移优于直接应用蛋白和质粒载体，为了探讨腺病毒介导VEGF－B基因对缺血心肌的血管新生作用，我们首先构建了编码人VEGF-B基因的复制缺陷的重组腺病毒（Ad．VEGF－B）载体，在体外研究证实对血管内皮细胞具有促增殖作用的基础上，直接注射猪慢性缺血心肌以评价在体应用的效果。 2 男二罩巨大誉协士够位锗大 申穴凶昙 们叱外斗专业 — —： 1．VEGFB腺病毒粘粒载体（pAxCAwtEGFB CDNA）的构建 抽提人心肌组织总 RNA，经 RT－PCR合成 VEGFB cDNA，扩增后酶切鉴定，将纯化的目的基因插入测序载体 pUC，转化感受态大肠杆菌 TG；进行扩增和抽提，获得正确的目的基因 VEGF－B CDNA，插入有腺病毒基因组的粘粒载体 pAxCAWt，扩增后挑选插入方向正确的克隆。 2．VEGFB基因重组腺病毒载体Ad．VEGF－B的构建 应用磷酸钙共沉淀法将DNA－TPC和重组粘粒pAxCAwtEGF－B CDNA转染293细胞，培养8～18天后挑选病毒克隆，同样的方法构建表达大肠杆菌p一半乳糖昔酶的LacZ基因腺病毒载体，经限制性内切酶酶切鉴定正确的病毒克隆进一步扩增后氯化锥梯度超速离心，应用TICD扣法测定滴度。以Ad．LgCZ感染Hela细胞，经X名al染色确定转染效率，并初步观察转染后细胞生长和形态评价其毒性。 3．Ad．VEGFE体外转染心肌细胞和对血管内皮细胞促增殖作用的研究 分离培养胚胎鼠心肌细胞（FCM）和成鼠主动脉内皮细胞（ohCS），免疫组化鉴定，分别以不同MOI（每个细胞的病毒噬斑形成单位pm／cell）值的Ad儿acZ转染FCMs、RAECs，应用X唱al染色测定转染效率，以MOI值20的AdVEGF8感染FCMs和 RAECs，以 Ad．LacZ、PBS为对照，转染后 1、3、7天进行 RTICR检测其转录，同时应用 Western Blot检测转染后细胞培养上清 VEGF－B的表达。MTh法测定Ad．VEGFB转染后7天内对RAECS的增殖作用。 4．Ad．VEGFB转染慢性缺血心肌促血管新生作用的研究 健康家猪14只，体重25～35kg，全麻下左第四肋间前外侧切口，分出左回旋支主干，放置内径2．snun的ineroid环。4周后冠状动脉造影确定其闭塞，分组用药。组1（Ad．VEGF－B组）5只，组＊（Ad工acZ组）5只，组＊（PBS组）4只，缺血区共注射 10点，每点 100 nl，病毒量为 10vfiJ，组H和组＊于 3、7、28天各处死 1只动物，应用X唱al染色评价慢性缺血心肌的转染效果。注药后28天左右心脏彩超检查测定节段性收缩期室壁增厚分数和短轴缩短率，体外冠状动脉造影检查侧枝血管的存在和分布；组织病理学观察心肌缺血、炎症程度，凝血Vlll因子相关抗原抗体免疫组化染色，200倍视野下进行血管计数。 3 ！二旱巨大攀俗士学位论大O丈的臀 用心外科专丛 一： 1．提取的总KNA和mRNA完整
葛永贵,王家宁,张群林,黄永章,王俊峰,潘庆敏,张绪国,彭贵海[9]（2000）在《经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病》文中指出目的 :观察经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子 （VEGF）基因转移治疗严重冠心病的疗效。方法 :2例病人均为严重弥漫性三支病变 ,临床上心绞痛为Ⅳ级 ,药物治疗效果不好 ,采用经皮冠脉内途径导入表达人VEGF16 5的腺病毒载体 （AdCMV .VEGF16 5 ）。结果 :手术操作过程中 ,患者耐受良好 ,无不良反应发生。两例均在术后 1h出现一过性发热 ,持续 3h ,经处理后体温恢复正常。未发生心肌梗塞 ,心律失常 ,血流动学不稳定或心功能改变 ,随访 6周未出现与腺病毒载体有关的心脏及全身不良反应。 2例病人心绞痛症状均显着改善 （由术前每天需 18～ 2 0片消心痛至术后 3～ 6片 /d ,心绞痛分级由术前Ⅳ级提高至术后Ⅱ级 ） ,术后 45d时冠脉造影示冠脉闭塞区域心肌侧支循环增加。结论 :通过这 2例初步经验 ,提示经皮冠脉内腺病毒载体介导的VEGF16 5基因转移治疗严重冠心病可促进侧支循环形成以及临床心绞痛症状改善。
蔡红雁[10]（2011）在《体外心脏震波治疗冠心病的临床疗效及其显效机理研究》文中指出[背景1由于冠心病（CAD）药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和冠状动脉旁路移植治疗（CABG）疗效有限、费用昂贵、技术复杂及并发症凶险,迄今尚无任何方法可以根治或基本解决CAD,人类迫切需要寻找高效、安全、简便、经济的冠心病新疗法。研究者纷纷开展了基因疗法和细胞移植,但是在操作中需要使用导管或开胸将基因或细胞植入心脏,具有不可重复性。体外心脏震波治疗系统（Extracorporeal Cardiac Shock Wave Therapy, CSWT）正是在此背景下产生,并已通过体外实验和动物模型证实,低能量的冲击波能促进受损的组织产生一氧化氮（NO）、血管内皮生长因子（VEGF）使其受体表达上调,从而促进缺血组织新生毛细血管的生成和加速侧支循环的建立,改善心肌缺血,提高心脏射血分数,减少左心室的重构,降低病死率。但体外心脏震波治疗改善缺血心肌微环境、促进缺血心肌组织内血管生成的作用机制尚不清楚。因此,深入研究体外心脏震波促血管新生的分子机制,寻找其作用靶点具有重要意义。第一部分：体外心脏震波治疗冠心病的临床疗效与安全性[目的1探讨CSWT治疗冠心病的有效性、安全性及显效机理,总结CSWT的方法学和技术细节,找寻CSWT治疗的适宜人群。[方法]2008年8月-2010年12月入住昆明医学院第一附属医院心内科的陈旧性心肌梗死、稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者26例,病史1-16年。所有患者经冠状动脉造影或多层螺旋CT冠脉成像发现冠脉中、重度狭窄,无论是否行PCI或CABG均给予正规药物治疗,仍有缺血症状,运动耐量改善不明显,1年内因上述原因住院2次以上。排除标准为急性心肌梗死1月内、左室射血分数低于30%者、严重慢性阻塞性肺病。使用多巴酚丁胺负荷超声心动图（DSE）和基础及负荷状态下99mTc-MIBI心肌灌注显像（MPI）识别并定位缺血/存活心肌;使用瑞士STORZ MEDICAL公司生产的震波治疗仪行体外心脏震波治疗,治疗时经机载实时超声探头锁定缺血靶区,每个靶区实施-1-0-+1两两组合的9点治疗,每点发放200次脉冲,每次脉冲能量为0.09mJ/mm2。整个过程实时心电、血压、血氧饱合度监测。所有患者均于治疗前后行6分钟步行距离（6MWT）、NYHA心功能分级、CCS心绞痛分级、SAQ评分、硝酸甘油用量、事件追踪等评价疗效；采用静息及负荷状态下收缩期峰值应变率（PSSR）和MPI评价局部心肌收缩功能和血流灌注,测量左室舒张末内径（LVDd）和左室射血分数（LVEF）等评价CSWT的疗效及安全性。在震波前、第3次及第9次震波后分别行心肌酶学检测。[结果]26例患者均顺利完成CSWT疗程,无呼吸困难、心力衰竭、晕厥、栓塞、心悸、出血或休克等并发症。DSE和负荷MPI共同检出存活／缺血心肌节段40个。26例患者治疗后6MWT、NYHA心功能分级、SAQ和CCS心绞痛分级明显改善[6MWT:（360.69±116.79）m比（434.15±86.29）m, NYHA:（1.85±0.21）比（1.23±0.08）,SAQ（67.58+13.03）比（77.54±10.84）,均P<0.01,CCS：（1.85+0.15）比（1-9±0.08）,P<0.001],硝酸甘油用量明显减少[（1.00±0.27）比（0.50±0.19）,P<0.01]；基础和负荷状态下MPI明显增加[基础：（1.04±0.19）比（2.16±0.16）,P<0.001；负荷：（0.80±0.16）比（1.40±0.16）,P<0.01]；PSSR基础状态下无明显改变[（1.04±0.43）比（1.21±0.62）,P>0.05],负荷状态下明显增强[（1.35±0.66）比（2.02±1.00）,P<0.001]。LVDd和LVEF无明显改变[LVDd:（53.81±7.34）mm比（53.27±6.68）mm; LVEF（53.69±12.70）%比（55.27±10.87）%,均P>0.05]；心肌酶学治疗前后无明显改变（P>0.05）。[结论]①CSWT治疗复杂CAD无创、安全、有效,治疗早期就显示缓解心绞痛症状、增加冠脉储备、多项心肌灌注指标改善、生活质量提高。②CSWT可能是通过促缺血区心肌血管新生达到发挥治疗CAD作用。③CSWT治疗的适应人群似可扩展到非终末期CAD患者。④DSE联合负荷MPI可更准确检出微血管性缺血心肌,可提高CSWT靶心肌定位的精确性和有效性。⑤CSWT治疗的范围、能量应根据患者具体情况个体化实施。第二部分：体外心脏震波诱导EPCs增殖促缺血心肌血管新生的研究[目的]探讨经CSWT治疗后CAD患者外周血EPCs增殖情况和相关细胞因子变化。[方法] 26例CAD患者与第一部分相同,所有患者均在治疗前后采集外周血单个核细胞,分别行EGM-2-MV培养基培养,观察EPCs形态和集落形成数量,激光共聚焦显微镜鉴定EPCS;流式细胞术（Flow Cytometry）直接检测外周血EPCs数量；ELISA法检测治疗前后外周血细胞因子VEGF、IL-8、SDF-1和MMP-9的水平。[结果]体外培养的EPCs数量、细胞集落形成数较治疗前明显增多[（18.85±4.30）和（5.08±1.79）个／高倍视野比（30.12±6.77）和（12.27±2.75）个／高倍视野,均P<0.001]；外周血EPCs数量较治疗前明显增多[（0.015±0.003）%比（0.021±0.005）%,P<0.001]；外周血细胞因子VEGF、IL-8较治疗前明显增加[VEGF:（120.26±19.85）pg/ml比（155.19±24.67）pg/ml, IL-8:（21.81±5.94） pg/ml比（149.70±44.11）pg/ml,均P<0.01]；SDF-1、MMP-9较治疗前无明显变化[SDF-1：（2750.87±636.74）pg/m比（2700.47±415.19）pg/ml, MMP-9:（19.66±3.96） ng/ml比（18.55±3.78）ng/ml,均P>0.05]。[结论]①CSWT治疗似可促进VEGF、IL-8蛋白质的表达。②CSWT治疗似可促进EPCs的增殖。③CSWT治疗似可显着提高外周血EPCs的数量及功能。④CSWT治疗对SDF-1、MMP-9表达的影响似不明显。第三部分：超声震波对HUVECs增殖及最佳能量探讨[目的1探讨不同强度超声震波能量对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、分化及相关细胞因子的影响,探寻超声震波的最佳能量。[方法]对体外培养的HUVECs细胞株施予不同级别能量（0,0.03,0.09,0.18,0.24mJ/mm2）的震波处理,CCK8比色法检测细胞增殖情况,Real-time PCR法、Western-blot法及Flow Cytometry法检测CSWT处理后细胞因子VEGF、IL-8、ICAM-1mRNA水平和蛋白质的水平变化。[结果]0.09mJ/mm2的震波能量显着促进HUVECs增殖（P<0.05）；Real-timePCR结果显示在使用0.09 mJ/mm2能量时HUVECsVEGF、IL-8和ICAM/1mRNA的表达较对照组明显增加（P<0.001）；使用0.03mJ/mm2能量显着增加ICAM-1mRNA的表达（P<0.01）,但没有增加VEGF、IL-8mRNA表达（P>0.05）；0.18mJ/mm2能量时显着增加VEGFmRNA的表达（P<0.01）,IL-8、ICAM/1mRNA的表达较对照组无明显增加（P>0.05）,0.24mJ/mm2能量时VEGF、IL-8、ICAM-1mRNA的表达较对照组无明显改变（P>0.05）;Western-blot结果显示在使用0.09 mJ/mm2能量处理HUVECs时VEGF、ICAM-1蛋白表达较对照组明显增加（P<0.05）；使用0.03、0.18、0.24mJ/mm2能量增加VEGF蛋白的表达（P<0.05）,ICAM-1蛋白表达较对照组无明显改变（P>0.05）;Flow Cytometry结果显示使用0.09：mJ/mm2能量时VEGF、IL-8表达明显较对照组增加（P<0.05）；0.03、0.18、0.24mJ/mm2能量显着增加VEGF的表达（P<0.05）,IL-8的表达较对照组无明显改变（P>0.05）。[结论]①体外不同震波能量处理HUVECs均有不同程度促增殖作用,0.09mJ/mm2的能量促细胞增殖作用显着。②0.09mJ/mm2的能量促进IL-8、ICAM-1 mRNA及其蛋白质水平表达最显着。③0.09mJ/mm2的能量促进VEGFmRNA及其蛋白质的表达最显着。④0.03-0.24mJ/mm2不同的能量对细胞因子VEGF、IL-8和ICAM-1的分泌也有一定的促进作用。本研究采用CSWT治疗CAD患者和处理体外培养的HUVECs,发现CSWT安全、简便,使CAD患者临床疗效和提示心肌灌注的客观指标改善,CSWT的显效机理可能是合适能量的震波促进多种细胞因子分泌、表达,促进EPCs和HUVECs增殖,进而促进心肌缺血区血管新生。
二、经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病（论文提纲范文）
（1）水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 两种水母刺丝囊毒素的多组学比较分析 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 越前水母刺丝囊环γ-聚谷氨酸的分离、鉴定及其生物学功能 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 环γ-聚谷氨酸涂层的双重响应性载阿霉素纳米胶束及其抗肿瘤效应 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 综述一 血管内皮生长因子介导的血管新生疗法在心血管疾病中的研宄进展 |
| 综述二 γ-聚谷氨酸在构建纳米药物传递系统中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1. 对象和方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.1.1 实验动物与饲料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 射频温控球囊消融对家兔正常血管的影响 |
| 1.2.2 射频温控球囊消融动脉粥样硬化血管情况 |
| 1.2.3 样本采集 |
| 1.2.4 测量指标 |
| 1.2.5 HE染色 |
| 1.2.6 Masson染色 |
| 1.2.7 Realtime PCR方法 |
| 1.2.8 western blot方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 射频温控球囊消融对家兔正常血管的影响 |
| 2.1.1 温控球囊对血管影响 |
| 2.1.2 比较温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔主动脉作用 |
| 2.1.3 温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔主动脉纤维化情况 |
| 2.2 射频温控球囊对家兔动脉粥样硬化血管的影响 |
| 2.2.1 组织病理学改变 |
| 2.2.2 比较温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔粥状动脉硬化主动脉作用 |
| 2.2.3 免疫组化结果 |
| 2.3 射频温控球囊对家兔动脉血管的细胞因子转录水平的影响 |
| 2.4 射频温控球囊对家兔动脉血管的细胞因子蛋白水平的影响 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 PCI与动脉粥样硬化 |
| 3.2 射频消融(RFA) |
| 3.3 温控球囊血管成形术(RFPB) |
| 3.4 温控射频球囊成形术的安全性 |
| 3.5 温控射频球囊对血管壁成分以及血管内径的影响 |
| 3.5.1 温控射频球囊对血管内斑块内成分的影响 |
| 3.5.2 温控射频球囊对血管扩张维持的影响 |
| 3.5.3 凋亡和内膜增生 |
| 3.6 细胞因子在动脉粥样硬化发展中的作用 |
| 3.7 温控射频球囊对凋亡通路影响 |
| 3.8 研究不足之处 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 动脉粥样硬化与炎症因子及炎症通路 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）LncRNA MEG3及miRNA-361-5p在冠状动脉粥样硬化中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、LncRNA MEG3 通过miRNA-361-5p调节血管平滑肌细胞增殖与凋亡的研究.. |
| 技术路线图 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验细胞的准备 |
| 1.1.4 构建ox-LDL诱导的VSMCs损伤模型 |
| 1.1.5 RT-PCR技术 |
| 1.1.6 Western Blot技术 |
| 1.1.7 细胞转染 |
| 1.1.8 细胞增殖试验 |
| 1.1.9 细胞凋亡检测 |
| 1.1.10 双荧光素酶报告分析 |
| 1.1.11 RNA免疫沉淀反应 |
| 1.1.12 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 LncRNA MEG3和miR-361-5p表达与ox-LDL诱导的VSMCs损伤相关 |
| 1.2.2 抑制lncRNA MEG3 可促进VSMCs的增殖并抑制细胞凋亡 |
| 1.2.3 miR-361-5p与 lncRNA MEG3 存在靶定关系 |
| 1.2.4 LncRNA MEG3 影响miR-361-5p对其靶基因ABCA1 的调控 |
| 1.2.5 抑制LncRNA MEG3 可通过调节miR-361-5p促进VSMCs的增殖并抑制凋亡 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LncRNA MEG3与VSMCs增殖及凋亡水平的关系 |
| 1.3.2 MiR-361-5p与 VSMCs增殖及凋亡水平的关系 |
| 1.3.3 ABCA1与VSMCs增殖及凋亡水平的关系 |
| 1.3.4 抑制lncRNA MEG3 通过调节miR-361-5p促进VSMCs的增殖并抑制凋亡 |
| 1.4 小结 |
| 1.4.1 LncRNA MEG3和miR-361-5p表达与ox-LDL诱导的VSMCs增殖及凋亡相关。 |
| 1.4.2 抑制lncRNA MEG3 的表达可促进VSMCs的增殖并抑制细胞凋亡。 |
| 1.4.3 LncRNA MEG3与miR-361-5p在 VSMCs的增殖及凋亡过程中存在靶定关系。 |
| 1.4.4 LncRNA MEG3 影响miR-361-5p对其靶基因ABCA1在VSMCs的增殖及凋亡过程中的调控。 |
| 二、ACS患者外周血MEG3、miR-361-5p的表达 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 患者的选择 |
| 2.1.2 标本的收集及处理 |
| 2.1.3 实验设备仪器及试剂 |
| 2.1.4 RT-PCR技术 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 四组患者间一般情况的比较 |
| 2.2.2 冠心病患者冠脉病变情况与RNA相对表达量的关系 |
| 2.2.3 冠状动脉介入检查或治疗对RNA相对表达量的影响 |
| 2.2.4 不同靶病变形态与PCI术后RNA相对表达量变化的关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 RNA相对表达量与ACS |
| 2.3.2 RNA相对表达量与冠脉病变形态 |
| 2.3.3 RNA相对表达量与PCI |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 论文局限性 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 lncRNAs在动脉粥样硬化中作用的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）胸腺素β4基因调节内皮细胞功能及其干预心肌损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 综述1 血管内皮功能障碍与心血管疾病 |
| 综述2 胸腺素β4 在心脏保护和修复中的作用 |
| 第一部分 携带胸腺素β4 基因序列腺病毒载体制备 |
| 前言 |
| 阶段1：全基因合成及腺病毒载体的构建 |
| 一 材料与方法 |
| 二 实验结果和数据 |
| 阶段2：腺病毒的包装和滴度的测定 |
| 一 材料与方法 |
| 二 实验结果和数据 |
| 讨论 |
| 第二部分 胸腺素β4 基因修饰内皮细胞的体外研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 携带 Tβ4 基因腺病毒治疗家猪急性心肌梗死的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 脾功能亢进对心力衰竭患者胸腺素β4 水平的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件(基因测序图) |
（5）靶向干预NF-κB信号通路防治老龄缺血性心力衰竭的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 老龄小鼠急性心肌梗死后NF-κB信号通路的表达 |
| 第一节 老龄小鼠心肌梗死模型及心脏衰竭模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 主要方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 老龄小鼠急性心肌梗死后及心衰中NF-κB信号通路的表达 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物的选择与与分组 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 Western Blot检测IKBα、p65和p50 表达 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CMV启动子重组ss AAV9和ds AAV9 载体对小鼠心肌组织特异性表达研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.2 主要器材和试剂配制方法 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 NF-κB基因靶向转导减轻老龄心肌缺血性心力衰竭 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 病毒转染 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 NF-κB在心脏中作用的多样性 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）肌浆网钙ATP酶基因转导治疗急性心肌梗塞的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 国内外研究现状 |
| 2 研究的意义和价值 |
| 第一部分 扩增和纯化携带SERCA2a重组腺病毒的实验方法 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 过表达SERCA2a基因治疗急性心肌梗塞后心力衰竭的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 过表达SERCA2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗塞的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 过表达SERCA2a基因、骨髓干细胞移植和过表达SERCA2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗塞的对比实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）Ad-hVEGF121重组腺病毒基因治疗对急性心肌梗死大鼠心脏保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、第一部分 携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 二、第二部分 大鼠急性心肌梗死模型制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 三、第三部分 血管内皮生长因子对急性心肌梗死大鼠左心功能和心肌细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 基因治疗及其在缺血性心血管疾病中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生的研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写 |
| 前言 |
| 第一部分 血管内皮生长因子B重组腺病毒粘粒载体（pAxCAwt.VEGF－B）的构建 |
| 第二部分 VEGF—B基因重组腺病毒载体Ad.VEGF-B的构建 |
| 第三部分 Ad.VEGF-B体外转染心肌细胞和对内皮细胞促增殖作用研究 |
| 第四部分 Ad.VEGF-B转染猪慢性缺血心肌促血管新生作用的研究 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 重组腺病毒 |
| 1.3 经皮冠脉内腺病毒载体导入 |
| 1.4 术后随访 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pAdCMV.VEGF165的酶切鉴定结果 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 冠脉造影结果 |
| 3 讨论 |
（10）体外心脏震波治疗冠心病的临床疗效及其显效机理研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 第四部分 文献综述 |
| 就读期间发表论文和科研获奖情况 |
| 致谢 |
四、经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病（论文参考文献）
- [1]水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用[D]. 王超. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [2]温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响[D]. 夏晓东. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]LncRNA MEG3及miRNA-361-5p在冠状动脉粥样硬化中的作用及机制[D]. 王明辉. 天津医科大学, 2019(02)
- [4]胸腺素β4基因调节内皮细胞功能及其干预心肌损伤的研究[D]. 汤涌. 东南大学, 2018(01)
- [5]靶向干预NF-κB信号通路防治老龄缺血性心力衰竭的作用机制研究[D]. 贺春晖. 新疆医科大学, 2016(05)
- [6]肌浆网钙ATP酶基因转导治疗急性心肌梗塞的实验研究[D]. 范平. 新疆医科大学, 2013(02)
- [7]Ad-hVEGF121重组腺病毒基因治疗对急性心肌梗死大鼠心脏保护作用的实验研究[D]. 寿松涛. 天津医科大学, 2008(12)
- [8]腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生的研究[D]. 董书强. 第二军医大学, 2001(01)
- [9]经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病[J]. 葛永贵,王家宁,张群林,黄永章,王俊峰,潘庆敏,张绪国,彭贵海. 郧阳医学院学报, 2000(04)
- [10]体外心脏震波治疗冠心病的临床疗效及其显效机理研究[D]. 蔡红雁. 昆明医学院, 2011(09)